生物酶對初沉污泥厭氧發酵產短鏈脂肪酸的調控研究

劉國華,王 健,齊 魯,王洪臣

生物酶對初沉污泥厭氧發酵產短鏈脂肪酸的調控研究

劉國華,王 健,齊 魯*,王洪臣

(中國人民大學環境學院低碳水環境技術中心,北京 100872)

旨在通過生物酶調節(堿性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶)提高初沉污泥的厭氧發酵效率,并通過微生物群落結構解析,SCFAs (short-chain fatty acids,SCFAs)組分分析等揭示其調控機理.結果表明,3種生物酶均可增強初沉污泥水解和產酸作用,堿性蛋白酶調控系統對初沉污泥厭氧發酵的促進效果最為明顯,發酵第4d SCFAs的產量和產率分別達到1508mg COD/L和0.174g COD/g VSS.對比控制組,SCFAs的產量和產率分別增加了1129mg COD/L和0.13g COD/g VSS.微生物群落結構分析表明,在堿性蛋白酶調控發酵系統中,、和等發酵相關菌群的相對豐度得到了改善,、等產甲烷古菌的活性受到了抑制.同時,生物酶調控對促進發酵過程乙酸占比也有促進作用.

生物酶；短鏈脂肪酸；初沉污泥；厭氧發酵；調控

當前,我國污水處理廠普遍存在進水碳源不足的問題,導致生物脫氮除磷效率低下,因此往往需投加乙酸鈉或甲醇等外部碳源以提高脫氮除磷效果.然而,投加外部碳源會大大增加污水處理成本,所以內部碳源的開發顯得尤為重要.厭氧環境下污泥發酵可產出大量可溶性有機質,其中短鏈脂肪酸(SCFAs)是極易被微生物利用的高效碳源.污水處理廠初次沉淀池污泥(后稱“初沉污泥”)有機物含量為55%～70%,蛋白質和碳水化合物占40%以上[1].因此,初沉污泥厭氧發酵是污水處理廠生產SCFAs的一種經濟有效的方式[2-3].

厭氧發酵過程主要包括水解,產酸和產甲烷等階段.其中,水解是發酵過程中主要的限速步驟,菌之間的競爭決定了主要發酵產物的形成[4].研究表明,生物酶預處理可以提高污泥的水解效果[5],但是其對于整個初沉污泥發酵過程的影響規律和機理研究較少,并且在污泥發酵過程中采用的生物酶調控手段尚不全面[6-7].因此,本文探究不同種類生物酶(堿性蛋白酶,中性蛋白酶,α-淀粉酶)對初沉污泥厭氧發酵產SCFAs的影響,并通過分析發酵系統中參與生物水解,產酸和產甲烷生成的關鍵微生物,揭示了其影響機理.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用初沉污泥取自北京市某再生水廠的初沉池,該污水處理廠采用傳統活性污泥工藝.將所取污泥在4℃下保存.厭氧發酵系統的接種用污泥從該廠的厭氧污泥消化池取得.實驗所用初沉池污泥及消化污泥的主要參數如表1所示,所用生物酶購自北京博奧拓達科技有限公司.

表1 實驗所用污泥性質

注:碳水化合物,蛋白質為污泥離心上清液過0.45 μm膜后含量,NH4+- N,PO43--P為污泥離心上清液中的含量.

1.2 實驗方法

將初沉污泥和消化污泥(接種)混合(質量比=4:1),然后轉移到至4個相同的發酵反應器中,混合污泥的TSS和VSS濃度分別為(22000±598)和(8684±325)mg/L.機械攪拌速度控制在(120±10) r/min,溫度保持在(36±1)℃.為了保持較高的酶活性,實驗前將粉末狀生物酶配置成酶溶液,具體的配置方法與耿娜瑤[8]報道的方法相同.在實驗開始前,分別按照10%酶投量(w/w)添加酶溶液至3個發酵反應器(R1～R3)中.之后連續14d觀察并采樣分析.

在發酵第1d酶每隔4h采集一次污泥樣品,之后每24h從反應器中收集一次污泥樣品,并進行分析.此外,分別在發酵第0,3,5,9和14d收集污泥樣品于20mL離心管中并保存在-20℃的冰箱中,用于分析與水解,酸化及甲烷生成有關的微生物群落結構.

1.3 分析方法

氨氮、磷酸鹽、SCOD、TSS和VSS等根據標準方法測定[9].使用Lowry-Folin方法以牛血清蛋白為標準物質檢測可溶性蛋白含量[10].通過硫酸-蒽酮法以葡萄糖為標準物質測定可溶性碳水化合物含量.粒徑分布采用百特激光粒度分布儀進行測定.

SCFAs利用氣相色譜法(GC,Agilent,7890A)進行分析測定.待測樣品首先經過0.45μm濾膜過濾,取0.9mL待測樣品于安捷倫測樣棕色小瓶內,加入0.1mL磷酸進行酸化,隨后進樣至氣相色譜儀進行測定.氣相色譜的檢測器和色譜柱分別為氫火焰離子化檢測器(FID)和DB-WAXETR色譜柱 (30m′1.0μm′0.53mm).色譜條件:進樣口溫度為220℃,進樣體積為2μL;FID溫度為250℃.最后,按照乙酸1.07、丙酸1.51、正丁酸和異丁酸1.82、正戊酸和異戊酸2.04的換算系數將SCFAs濃度轉換為COD濃度[11].

使用FastDNA? Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, USA)從厭氧發酵反應器中的污泥樣品中提取DNA,并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA.然后使用5'熒光標記的正向引物(27F labeled with 6- carboxyfluorescein, 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC- AG-3')和通用反向引物(1492R,5'-GGTTACCTTG- TTACGACTT-3')對細菌16S rDNA進行PCR擴增[12].回收PCR產物,并使用回收試劑盒(E.Z.N.A.瓊脂糖凝膠)純化.最后,使用IonS5?XL MiSeq高通量測序(IonS5?XL Ion 530芯片,Thermo Fisher,美國)對純化的PCR產物進行測序.進行操作分類單位(OTU)聚類和分類分析,然后獲得微生物分布信息.通過Alpha多樣性和Beta多樣性分析,揭示樣品之間物種組成和群落結構的差異.

2 結果與討論

2.1 不同發酵系統中初沉污泥水解效果分析

在初沉污泥的水解過程中,通過化學和生物作用可將顆粒狀有機物水解或分解成可溶性有機物[13].因此,可以通過SCOD濃度隨時間的變化來反映初沉污泥的水解過程[8].

圖1結果顯示,相比之下,堿性蛋白酶對初沉污泥有機質有最好的溶出效果,在反應24h后,污泥上清液中SCOD濃度可達2915.5mg/L,中性蛋白酶次之,SCOD濃度為2210.5mg/L,α-淀粉酶對初沉污泥溶出效果相對較弱,SCOD濃度約為1459.5mg/L.結果表明,不同的生物酶可以一定程度提高污泥發酵液中的SCOD濃度(空白組為865mg/L),這主要是因為生物酶對于污泥顆粒中部分有機質的專一性水解作用.因為初沉污泥本身各組分組成存在差異,因此不同生物酶調控發酵系統出現不同的SCOD溶出效果.另外,由于生物酶發揮催化作用往往較為快速,一般在幾個小時內即可完成,因此在發酵的第1d顯示為快速水解過程, 1d后SCOD濃度在各組中均出現逐漸降低的趨勢,推測為微生物代謝消耗了部分污泥中溶解性有機物.而且,隨著酶促反應的進行,也存在酶活性中心被污泥有機質分子占據的情況,或者吸附作用導致酶反應活性的降低[14].總之,生物酶調控手段對于初沉污泥發酵而言,能在較短時間內促進污泥水解產生SCOD.

圖1 不同生物酶調控下SCOD濃度隨時間變化

表2 不同生物酶調控下第4d發酵系統內 SCOD凈產量及產率對照

Novak等[15]曾報道厭氧消化過程中蛋白質和多糖的降解均隨著酶活性的降低而降低.如圖2所示,在不同的生物酶調控條件下蛋白質和碳水化合物濃度的變化趨勢與SCOD的濃度變化相似.因此,可以認為SCOD的溶出與碳水化合物和蛋白質的溶出是同步的[16].在24h反應時間內,在堿性蛋白酶調控系統中,溶解態蛋白濃度和溶解態碳水化合物濃度分別上升至708和65mg/L水平;在中性蛋白酶實驗中,溶解態蛋白濃度和溶解態碳水化合物濃度分別上升至586和53mg/L水平;在α-淀粉酶實驗中,溶解態蛋白濃度和溶解態碳水化合物濃度分別上升至428和67mg/L水平.堿性蛋白酶促進效果最佳,主要因為堿性蛋白酶能很好的促進微生物細胞中的蛋白質組分,同時對污泥中顆粒態蛋白水解有一定促進作用[17].因此,對于污泥固相中蛋白質的溶出效果如下:堿性蛋白酶>中性蛋白酶>α-淀粉酶;對于污泥固相中碳水化合物類物質的溶出效果呈現:α-淀粉酶>堿性蛋白酶>中性蛋白酶.另外,蛋白質溶出效果明顯優于碳水化合物的主要原因為初沉污泥中蛋白質顆粒組分遠高于碳水化合物,而且酶活性易受發酵底物的影響,當污泥中酶作用的底物較多時,其活性也會較高[18].

2.2 不同發酵系統中有機物的酸化

由圖3(a)可以看出,在3種生物酶調控下SCFAs得到快速積累,在發酵第4d,各組的積累基本達到最高值,并且SCFAs溶出效果為:堿性蛋白酶>中性蛋白酶>a-淀粉酶.在堿性蛋白酶,中性蛋白酶,α-淀粉酶調控組中SCFAs的總量分別快速積累到1508, 1307和1144mg COD/L(空白組為379mg COD/L).表3顯示出了堿性蛋白酶,中性蛋白酶,a-淀粉酶調控組中SCFAs在發酵4d時間內的產率,分別為: 0.174,0.150和0.131g COD/g VSS(空白組為0.044g COD/g VSS).這種現象的主要原因是生物酶促進水解產生的溶解態有機物為產酸微生物發酵提供了有利底物.在發酵4d后,各系統中SCFAs均出現下降趨勢,推測為產甲烷菌利用了生成的SCFAs用于產甲烷,進而導致SCFAs的消耗.

圖3(b)顯示了各系統發酵第4d SCFAs組分的百分比.經生物酶調控后,乙酸是發酵系統中主要的SCFAs.相較于空白組,基于堿性蛋白酶,中性蛋白酶和α-淀粉酶3種堿調控系統中產出的SCFAs組分中乙酸占比從30%左右分別升至約49%、47%和49%.可以得出,生物酶調控通過促進蛋白質和碳水化合物類物質的溶出釋放,從而推動了發酵反應向產生SCFAs方向移動,生物酶調控發酵系統中乙酸占比升高是因為發酵過程更為徹底,進入了產氫產乙酸階段.同時,丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸很容易被厭氧微生物通過不同的代謝途徑降解為乙酸[19].

表3 發酵第4d SCFAs的產量和產率

如圖4,在空白系統中隨著發酵時間的延長,各種SCFAs積累量均在發酵約9d后趨于0,而生物酶調控組在14d依然保持較高水平.在調控發酵系統中,乙酸含量在第4d分別達到511mg/L(堿性蛋白酶)、429mg/L(中性蛋白酶)、395mg/L(α-淀粉酶).另外,在生物酶調控組中,異戊酸溶出量>丙酸溶出量,這主要是因為乙酸,丙酸和丁酸的生成主要由液相中蛋白和碳水化合物發酵而獲得,但是碳鏈較長的脂肪酸(如戊酸)主要來自于蛋白質發酵[20],實驗中由于蛋白質和碳水化合物溶出量存在差異,導致兩者的發酵速率也存在差異,進而引起了揮發性脂肪酸的組成比例差異.而且分析各生物酶調控系統,乙酸下降時間節點最早出現,因為系統中產甲烷菌更易消耗乙酸,而相對較難利用丙酸,丁酸和戊酸.

圖4 發酵過程中不同生物酶調控對SCFAs組分變化的影響

2.3 SCOD組分變化規律

圖5顯示了不同發酵系統在第4dSCOD各組分關系.可以看出,蛋白質和SCFAs在SCOD中占比較大,而碳水化合物的占比很小.同時,在不同的生物酶調控系統中,蛋白質和SCFAs的含量均顯著增加,這與辛曉東[14]的結果相似.而且,污泥發酵過程產生的SCFAs與發酵系統中溶解態蛋白質與碳水化合物的濃度相關[21].因此,在生物酶調控組中,使用堿性蛋白酶進行調控是提高可溶性蛋白和SCFAs產量的最有效方法.

圖5 第4d在不同發酵系統中的SCOD組成

2.4 氮磷溶出規律分析

在厭氧發酵過程中,氨主要由含氮有機物的水解和氨基酸,蛋白質等的發酵產生[8].磷則是微生物細胞的重要組成元素,因此磷主要由污泥發酵過程中細胞的破碎以及有機物的降解產生[22].由圖6可以看出,隨著發酵過程進行,系統中NH4+-N濃度呈現上升趨勢,而PO43--P濃度基本無變化,說明生物酶調控促進了初沉污泥中顆粒有機物的水解,同時也為蛋白質發酵提供了充足底物.對比各組NH4+-N溶出效果:堿性蛋白酶組>中性蛋白酶組>α-淀粉酶組.因此,相較于中性蛋白酶和α-淀粉酶,堿性蛋白酶對于促進初沉污泥發酵作用更為明顯.

2.5 VSS去除率和粒徑分布分析

VSS去除率可用于表征顆粒有機物等的水解效果[8].從7(a)可以看出,與空白系統相比,各生物酶調控手段對VSS去除均有一定促進作用,其促進效果呈現堿性蛋白酶>中性蛋白酶>α-淀粉酶,這與SCOD溶出和SCFAs產生的趨勢基本相同(圖2,圖3(a)).通過VSS去除率隨時間變化可以看出:各組在前2d VSS削減變化較明顯,2d后變化趨勢驅緩,這與SCOD溶出趨勢相似.而且,堿性蛋白酶調控系統VSS去除率最高,約為30%.這與Rashed等[23]的研究結果相似,不同的生物酶,不同污泥對污泥發酵過程VSS去除率效果均不同,但是與Noyola等[24]的研究結果不同,其原因可能因為所使用污泥性質存在一定差異.

圖7 不同酶調控系統的VSS去除率和14d后各系統粒徑分布

粒徑分布可用于分析污泥發酵過程中顆粒有機物的水解程度[7,14].在基于不同酶調控的發酵系統中,發酵14d后的粒徑分布如圖7(b)所示.與空白組相比,生物酶調控后系統中污泥的粒徑有微弱減小趨勢,表明生物酶調控對促進顆粒態有機物的水解有一定促進作用.

2.6 不同生物酶調控對微生物群落結構的影響

通過分析不同發酵系統之間的生物群落差異,可以分析生物酶對促進污泥發酵生產SCFAs的相關機理.由圖8可以看出,不同生物酶調控對污泥厭氧發酵體系中微生物群落影響明顯,各發酵體系中微生物群落具有相似性,但組與組之間也存在一定差異性.辛曉東[14]的研究表明微生物群落構成與變化同時受到底物有機負荷水平以及發酵體系中限制因子的影響.

為了表征空白系統和各生物酶調控系統之間功能性微生物菌屬組成的差異,在屬水平上利用豐度熱圖分析了各發酵反應器中的相關菌屬(圖8).空白組中的相對豐度均高于生物酶調控組,但是在各調控系統中仍舊存在一定量的產甲烷菌,這有效解釋了在發酵過程后期SCFAs的濃度在各組中均呈現下降的趨勢[25].同時,可直觀看出,與空白系統相比,在堿性蛋白酶調控系統中,、和等水解產酸菌屬的相對豐度明顯增加[26].在中性蛋白酶調控系統中,水解和產酸相關細菌屬,如和相對豐度也有增加[27-28].可以淀粉為生長底物,同時在蛋白質和肽的代謝中發揮重要作用.是一種專性厭氧菌屬,可發酵產生乳酸鹽、乙酸鹽和丁酸鹽.

如圖11所示,使用空白系統和不同生物酶調控系統之間的物種差異T檢驗分析圖來表征系統之間的物種差異.圖中列出了各生物酶調控系統與空白系統之間有明顯差異的菌屬(<0.05).

生物酶調控發酵系統中微生物群落結構與空白系統存在一定差異性,堿性蛋白酶組相較于空白組和等水解酸化菌屬差異性較大.是重要的蛋白質水解菌屬,同時也是重要的產乙酸菌屬[29].可用于處理含淀粉的高濃度有機廢水,可發酵葡萄糖產生乙酸鹽和丙酸鹽等[26].中性蛋白酶組相較于空白組和等菌屬相對豐度差異性較大.最早從厭氧乳清消化器中分離得到,其作用主要是還原硫酸鹽和單質硫生成硫化物,并非主要水解酸化作用功能菌屬[30].不可發酵碳水化合物,發酵蛋白質和脂質能力也較差[31].因此,中性蛋白酶組相較于空白組水解酸化功能菌產異性很小.α-淀粉酶組相較于空白組菌屬基本無差異性.因此,生物酶調控對于初沉污泥發酵而言主要能促進其水解過程,進而改善發酵底物環境,促進SCFAs的產出.

圖8 在不同生物酶調控系統中前35位微生物菌屬的豐度熱圖

JM:堿性蛋白酶,ZM:中性蛋白酶,DM:α-淀粉酶,B:空白

JM:堿性蛋白酶,ZM:中性蛋白酶,DM:α-淀粉酶,B:空白

3 結論

3.1 堿性蛋白酶、中性蛋白酶和α-淀粉酶3種生物酶均促進了SCFAs的產出.在發酵第4d,在3種生物酶調控系統中SCFAs的產量和產率均達到最大值,產量分別為1508、1307和1143mg COD/L;產率分別為0.174、0.150和0.131g COD/g VSS.

3.2 在堿性蛋白酶,中性蛋白酶和α-淀粉酶3種調控系統中,SCFAs組分中均以乙酸為主,分別可達49%、47%和49%.VSS削減和污泥粒徑分布的變化顯示,生物酶調控均能促進顆粒態污泥的水解.

3.3 生物酶調控抑制了發酵系統中、等產甲烷古菌的生長,而對水解酸化等發酵功能菌屬產生一定的富集優勢.其中,堿性蛋白酶的調控富集優勢最為明顯,、等水解、產酸功能相關菌屬與空白組之間存在明顯差異性.

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LIU Guo-hua, WANG Jian, QI Lu*, WANG Hong-chen

(Low-Carbon Water Environmental Technology Center, School of Environment, Renmin University of China, Beijing 100872, China)., 2022,42(5)：2195～2203

The objective of this study was to estimate the efficiency of SCFA production from primary sludge using bio- enzyme regulation including alkaline protease, neutral protease and α-amylase. The regulation mechanism was revealed by microbial community and SCFAs component analyses. The three kinds of bio-enzymes could enhance the hydrolysis and acid production during the fermentation of primary sludge. Compared with the blank group, the production and yield of SCFAs achieved 1508 mg COD/L and 0.174 g COD/g VSS on the fourth day of fermentation, respectively, increasing by 1129 mg COD/L and 0.13 g COD/g VSS. Microbial community structure analysis showed that the relative abundance of fermentation-relating bacteria such as,andwere improved, and the growth of methanogenic archaea such asandwas inhibited when bio-enzymes were added into the fermentation system. At the same time, the production of acetic acid in the regulated fermentation process was also found to promote.

bio-enzyme；Short-chain fatty acids (SCFAs)；primary sludge；anaerobic fermentation；regulation

X705

A

1000-6923(2022)05-2195-09

劉國華(1976-),內蒙古呼和浩特人,副教授,博士,主要研究方向為低碳污水處理技術,應用微生物技術.發表論文50余篇.

2021-09-14

中國人民大學科學研究基金資助項目(2020030257)

* 責任作者, 副教授, qilu@ruc.edu.cn