銅綠假單胞菌QS系統調控基因和毒力基因的攜帶、表達及與耐藥的相關性

周 凱，時翠銷，宋國濱，黃 穎，徐元宏

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa,PA)因產綠膿素而舊稱綠膿桿菌，是一種無孢子、專性需氧、運動和氧化酶陽性的革蘭陰性桿菌，被認為是最重要的機會致病菌之一，極易在免疫功能低下患者體內滋生[1]。研究[2]表明，PA可以分泌外毒素、彈性蛋白酶、胞外酶等多種毒力因子，在感染中起重要作用，同時對不同抗生素產生抵抗性也是毒力因子的一個屬性。而群體感應(quorum sensing，QS)系統是PA通過產生小的可擴散分子來增加其毒力的機制，可以調節毒力和營養獲取相關的一系列基因[3],也會影響抗菌藥物的敏感性。且伴隨著當前PA耐藥情況的加劇，新型藥物如毒力因子抑制劑、群體感應系統抑制劑的研發已成為治療PA的新方向。該研究著重分析了PA對11種臨床常用抗菌藥物的耐藥性，對PA常見的QS系統調控基因和毒力基因的攜帶、表達情況進行檢測，分析兩者與耐藥的相關性，并驗證了QS系統與毒力基因之間的調控關系，為臨床更有效地治療PA感染提供思路與依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源收集安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科2020年6月—12月PA97株，其中呼吸系統來源的46株(痰液39株、纖支鏡灌洗液7株)，其他系統來源的51株(創面9株、分泌物15株、尿液15株、血液6株、導管3株、引流液2株、組織1株)，同一患者相同部位分離株已剔除。對照菌株為本實驗室保存的PA標準菌株；質控菌株為大腸埃希菌ATCC8739、PAATCC27853，均來自本科室。

1.2 儀器和試劑哥倫比亞血平板 (合肥天達診斷試劑有限公司)；VITEK-MS質譜儀、Vitek2-Compact微生物鑒定儀(法國生物梅里埃公司)；藥敏紙片 (英國Oxoid公司)；Tap PCR Master Mix、擴增引物、瓊脂糖、DNA分子量標準、TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒、qPCR Master mix(上海生工生物工程股份有限公司)；LifeECO基因擴增儀(杭州博日科技有限公司)；凝膠成像系統(美國BIO-RAD公司)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀cobas z 480(羅氏分子有限公司)。

1.3 菌株鑒定及藥物敏感性實驗選取菌株后在血平板上分區劃線接種培養，待長出菌落后用質譜儀進行重新鑒定。鑒定明確后應用Vitek2-Compact儀進行藥敏試驗，缺少的抗菌藥物用紙片擴散(K-B)法補全，以2020年美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)文件為參照進行藥敏結果判讀及統計。

1.4 QS系統調控基因及毒力基因檢測

1.4.1DNA模板的制備 將鑒定后的菌株再次進行接種、孵育培養留取菌落，采用煮沸法獲取基因擴增所需DNA模板，整個過程防止污染，避免影響后續操作及結果。

1.4.2基因擴增及電泳 基因種類及PCR引物序列(表1)根據文獻[4-5]獲得，并委托上海生工生物工程股份有限公司合成，目的基因擴增總體系為25 μl, 熱循環參數：初始變性95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，53～69 ℃退火30 s，72 ℃、60 s，循環35個周期；最終72 ℃延伸10 min，產物置于4 ℃待電泳。每株各取10 μl PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察電泳結果并留存圖像。

表1 QS系統調控基因及毒力基因引物序列

1.4.3核苷酸序列測定與分析 將擴增的陽性PCR產物委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序。將所測序列與NCBI數據庫收錄的基因序列作比對。

1.5 調控基因及毒力基因表達水平檢測根據電泳及測序結果篩選出基因型相同的28株PA(其中14株為多重耐藥PA(multidrug resistantPseudomonasaeruginosa，MDR-PA))于溫箱搖菌過夜，運用TRIzol法提取RNA，檢測其濃度、純度后進行逆轉錄。并對其中兩種調控基因(LasI、rh1R)，兩種毒力基因(exoS、PCN)進行qRT-PCR檢測，qRT-PCR引物序列見表2。過程中以16S rRNA作為內參基因，PA標準菌株作為對照組。熒光定量完成后采用相對定量法2-ΔΔCt計算各菌株基因的表達水平。

表2 qRT-PCR調控基因及毒力基因引物

1.6 統計學處理使用SPSS 20.0軟件進行分析，對調控基因及毒力基因與耐藥性的相關性分別應用t檢驗、χ2檢驗進行分析，利用線性相關系數分析調控基因LasI、rh1R與毒力基因exoS、PCN的關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PA對11種常見抗菌藥物的耐藥率及分析97株PA對11種常見抗菌藥物的耐藥率最高的為亞胺培南25.77%，其次為氨曲南24.74%，最低為阿米卡星2.06%，見表3。其中43株為MDR-PA且多數對四種及以上抗菌藥物耐藥。根據標本來源不同分為呼吸系統(痰、纖支鏡)來源和其他部位來源兩大類，呼吸系統來源的菌株對抗菌藥物的耐藥率相對更高，且對氨曲南、頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率的差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表3 97株PA對11種抗菌藥物的藥敏結果[n(%)]

表4 不同來源PA對11種抗菌藥物耐藥性分析[n(%)]

2.2 QS系統調控基因及毒力基因檢測結果QS系統調控基因LasI、LasR、Rh1I、Rh1R均檢出且檢出率為100%；7種毒力基因也均被檢出，檢出率由高到低依次為exoT 98.97%(96/97),exoY 97.94%(95/97),ToxA 97.94%(95/97)，LasB 96.91%(94/97)，exoS 86.60%(84/97)，PCN 43.30% (42/97),exoU 13.40%(13/97)，PCR陽性條帶見圖1。

圖1 QS系統調控基因、毒力基因陽性條帶圖M：marker；1～11：LasR、LasI、rh1I、rh1R、exoS、exoT、exoY、exoU、lasB、PCN、ToxA基因陽性條帶

2.3 QS系統調控基因及毒力基因測序分析測得的基因序列與NCBI基因庫比對，一致率在98%以上。部分基因測序結果，見圖2～4。

圖2 LasR基因測序圖

圖3 exoU基因測序圖

圖4 PCN基因測序圖

2.4 毒力基因與耐藥性的關系攜帶不同毒力基因菌株的耐藥性有所不同，其中未攜帶毒力基因的菌株對頭孢他啶等6種抗菌藥物耐藥，攜帶有7種毒力基因的菌株對頭孢他啶耐藥；PCN、exoS、exoU陽性菌株中，非多重耐藥PA(non-multidrug resistantPseudomonasaeruginosa，NMDR-PA)所占比例更高；與PCN-菌株之相比，PCN+菌株對頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等藥物的耐藥率相對較高，且對哌拉西林/他唑巴坦的差異有統計學意義(P<0.05)；exoS+/exoU- 菌株對阿米卡星等大部分藥物較exoS-/exoU+菌株耐藥率相對更高，其中對頭孢他啶、妥布霉素、慶大霉素的差異有統計學意義(P<0.05)；PCN-/exoS+/exoU-與PCN+/exoS+/exoU-之間的耐藥率也有所差異，其中PCN+/exoS+/exoU-對抗菌藥物的耐藥率更高，且對哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟、美洛培南耐藥率的差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 攜帶不同毒力基因的PA耐藥性分析[n(%)]

2.5 調控基因和毒力基因表達水平及分析調控基因LasI、rh1R在28株PA菌株中均有表達，表達水平見圖5，其中，與14株MDR-PA相比，NMDR-PA

圖5 28株PA調控基因rh1R、LasI表達水平

調控基因rh1R、LasI的相對表達量更高，且LasI的差異有統計學意義(P<0.05)。 毒力基因exoS均有表達，而PCN表達不完全，隨機挑選15株四種基因全部表達的菌株，分別分析兩種調控基因與兩種毒力基因相對表達量的關系，調控基因rh1R與毒力基因exoS之間的表達呈正向線性關系(P<0.05)，相關系數r=0.685 ；調控基因LasI與毒力基因PCN之間的表達呈正向線性關系(P<0.05)，相關系數r=0.692。見圖6。

圖6 15株PA調控基因rh1R、LasI及毒力基因exoS、PCN的表達水平

3 討論

PA是院內感染中最常見的病原菌之一,而且致病及耐藥機制復雜，對其防治是醫務工作中的巨大挑戰，因此對臨床標本分離PA的研究具有重要價值。本文較國內其他相關分析報道，擴大了毒力因子范圍并加入了對QS系統調控基因及PA耐藥情況的監測。本研究中97株PA的耐藥率與李國強[6]監測的PA臨床重點藥物敏感率有所不同，其中對碳青霉烯類藥物(亞胺培南、美洛培南)耐藥率較頭孢類藥物(頭孢他啶、頭孢吡肟)高，考慮可能是不同地區對PA的耐藥性產生影響。其中近1/2為MDR-PA，且多數對四種及以上抗菌藥物耐藥，因此，重視藥敏結果，選擇有效的藥物聯合來抑制或殺滅MDR-PA是臨床治療其感染的有效方案[7]。同時，該研究提示呼吸系統來源菌株的耐藥性相對更高，與全國細菌耐藥檢測網的結果[8]一致。

本研究選取了Lasl、LasR、Rhll、RhIR四種調控基因進行檢測，且檢出率均為100%，說明調控基因在PA中是穩定存在的，一般不會發生缺失。挑選兩種調控基因LasI、RhIR進行表達量的檢測，結果顯示兩者在NMDR-PA中表達量相對更高，且LasI的差異有統計學意義。同時結果顯示調控基因能正向調控毒力基因的表達，由此可以看出QS系統在PA耐藥及其毒力表達方面具有重要作用。目前已有研究[9]提出抑制QS系統作為治療PA的靶點，如近來Abbas et al[10]研究表明西格列汀作為一種新型的抗群體感應藥物，可用于由PA造成感染的糖尿病或非糖尿病患者的預防和治療，所以在治療過程中應注意必要時抗群體感應藥物的使用。

該研究根據毒力基因檢出率及組合分析，未檢測到毒力基因的菌株對頭孢他啶等6種抗菌藥物耐藥，而含有7種毒力基因的菌株僅對頭孢他啶耐藥；前者耐藥性明顯高于后者，同時在PCN、exoS、exoU陽性菌株中，NMDR-PA所占比例更高，這與調控基因Rh1R、LasI在NMDR-PA中相對表達量更高較一致；因此推測PA可能存在高毒力低耐藥的現象。ToxA檢出率為97.94%，與相關報道[4]類似。lasB檢出率為96.91%，明顯高于內蒙古地區[11]檢出率，這可能與菌株選擇或地區分布有關；因此應重視對LasB的研究，探討本地區有高檢出率的原因，或許有利于對PA的監測與治療。PCN檢出率為43.30%，其中PCN+菌株對哌拉西林/他唑巴坦耐藥率更高且差異有統計學意義。而Dietrich et al[12]已研究表明綠膿菌素可以上調外排泵mexGHI-opmD基因的表達，而外排泵系統是PA重要的耐藥機制之一，同時有哌拉西林/他唑巴坦能夠對PA外排泵系統MexAB-OprM、MexXY-OprM影響的報道[13],因此進行PCN陽性菌株對哌拉西林/他唑巴坦耐藥性研究有一定的價值。

同時有研究[14]表明PA致病的毒力因子主要來自Ⅲ型分泌系統(T3SS)，分泌exoT、exoY、exoS和exoU四種細胞毒素，exoY、exoT在大多數菌株中都會表達，且毒性相對較弱；PA一般只表達exoS或exoU其中的一種，且絕大多數以exoS+/exoU-的形式存在[15]，本研究結果與之也較為一致。且本研究表明exoS+/exoU-相比于exoS-/exoU+對多數抗菌藥物的耐藥性更強，與張秀彩 等[16]的研究結果不同，推測可能由兩種毒力因子效應不同引起；exoU毒性是exoS的100倍，因此exoS+/exoU-可以讓宿主細胞維持更長的存活時間，讓其獲得更多接觸抗菌藥物的時間與機會，從而產生較強的耐藥性。這也與前文推測的高毒力低耐藥現象相吻合。同時，本研究將PCN聯合exoS、exoU進行分析，與單獨分析兩者時的結果相比，PA耐藥率發生改變且有統計學意義的藥物數量增加；說明各系統間不是彼此獨立的，而是一個相互影響的整體，這也提示對PA的探索研究應努力做到全面細致。