粉防己堿對慢性炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用

李峰 孫丹妮 婁崢 龔邦 周亞麗 余明輝 卿蘭玉

摘要 目的：研究粉防己堿對弗氏完全佐劑（FCA）致慢性炎性疼痛小鼠模型的鎮(zhèn)痛作用。方法：建立FCA足底慢性炎性疼痛模型，使用粉防己堿進(jìn)行干預(yù)治療，結(jié)合機械刺激、熱輻射刺激、熱板實驗及傷害性反應(yīng)等疼痛行為學(xué)檢測方法鑒定其鎮(zhèn)痛作用特點，使用實時PCR、蛋白質(zhì)印跡法等檢測辣椒素瞬時受體電位1（TRPV1） mRNA和蛋白表達(dá)變化，探究其干預(yù)作用TRPV1敏化調(diào)控途徑機制。結(jié)果：獲得了慢性炎性疼痛的小鼠模型。粉防己堿可顯著增加該慢性炎性疼痛模型的機械刺激和熱輻射刺激痛閾值，卻不影響該模型的熱板刺激痛閾值及小鼠體質(zhì)量，與正常對照組比較，粉防己堿干預(yù)后，F(xiàn)CA致慢性炎性疼痛小鼠模型的TRPV1產(chǎn)生明顯減少（P<0.05）。結(jié)論：粉防己堿能顯著抑制FCA致慢性炎性疼痛小鼠模型的TRPV1產(chǎn)生，對慢性炎性疼痛具有鎮(zhèn)痛作用，且未發(fā)現(xiàn)耐受性及毒性。

關(guān)鍵詞 粉防己堿;弗氏完全佐劑;慢性炎性疼痛;疼痛機制;辣椒素瞬時受體電位1;鎮(zhèn)痛;干預(yù)治療;行為學(xué)檢測

Analgesic Effect of Tetrandrine on Chronic Inflammatory Pain

LI Feng，SUN Danni，LOU Zheng，GONG Bang，ZHOU Yali，YU Minghui，QING Lanyu

（Changsha Medical University，Changsha 410219，China）

Abstract Objective：To investigate the analgesic effect of tetrandrine（TEF） on chronic inflammatory pain induced by Freund′s complete adjuvant（FCA） in mice.Methods：A FCA plantar chronic inflammatory pain model was established，and TEF was used to conduct intervention treatment.The analgesic effect of TEF was determined by pain behavioral tests of mechanical stimulation，thermal radiation stimulation，hot-plate test，and nociceptive response.Real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR），Western blot and other methods were used to detect the messenger ribonucleic acid（mRNA） and protein expression changes of transient receptor potential vanilloid-1（TRPV1），and to explore the regulatory pathway and mechanism of TRPV1 sensitization.Results：The model of chronic inflammatory pain in mice was obtained.TEF significantly increased the pain thresholds of mechanical stimulation and thermal radiation stimulation in mice，but did not affect the pain threshold of hot plate stimulation and the weight of mice.Compared with the control group，TRPV1 in the mice with FCA-induced chronic inflammatory pain was significantly reduced after the intervention of TEF（P<0.05）.Conclusion：TEF significantly inhibited the production of TRPV1 in the mice with FCA-induced chronic inflammatory pain，and had analgesic effect on chronic inflammatory pain.No tolerance or toxicity of TEF has been found.

Keywords Tetrandrine; Complete Freund′s adjuvant; Chronic inflammatory pain; Pain mechanisms; Transient receptor potential vanilloid-1; Analgesic effect; Intervention therapy; Behavioral tests

中圖分類號：R277.7;R285.5;R749.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.015

疼痛是90%以上人類疾病所共同具有的癥狀。世界衛(wèi)生組織提出“慢性疼痛是一種疾病”[1]。其中，尤以慢性炎性疼痛（Inflammatory Pain）最為常見，它表現(xiàn)出持久性、反復(fù)性的疼痛。慢性炎性疼痛發(fā)病機制非常復(fù)雜，研究表明慢性炎性疼痛首先由損傷組織釋放大量的腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等炎癥介質(zhì)，繼而引發(fā)炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生一系列致痛物質(zhì)，這些炎癥介質(zhì)及致痛物質(zhì)通過刺激外周傷害性感受器，在該傷害性感受器中將傷害性刺激轉(zhuǎn)換成動作電位，傳入外周傷害性感受器末端及背根神經(jīng)節(jié)，并將存在于其中的瞬時受體電位（Transient Receptor Potential，TRP）離子通道尤其是辣椒素瞬時受體電位（Tansient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1）通道敏化，引起疼痛[2-3]。慢性炎性疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展激活了TRPV1通道蛋白的表達(dá);在慢性炎性疼痛模型中，TRPV1拮抗劑能明顯增高機械痛閾值和熱敏痛閾值，從而使TRPV1通道蛋白成為普遍關(guān)注的疼痛治療靶點。

目前臨床上鎮(zhèn)痛藥主要有阿片類（Opioids）和非甾體抗炎藥（Nonsteroidal Anti-inflammatory Drug，NSAID），然而，阿片類藥物常常會產(chǎn)生耐受性、嗜睡、便秘、抑制呼吸和成癮性等不良反應(yīng)[4];NSAID也會伴隨胃潰瘍、胃出血、心肌梗死和腦卒中等不良反應(yīng);因此，臨床鎮(zhèn)痛治療受到一定的限制。近年來，中醫(yī)藥對慢性炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用研究越來越多[5-7]。

粉防己，防己科植物粉防己草（Stephania tetrandra S.Moore）的干燥根，常用于治療水濕所致的水腫病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，其所治療疾病多伴隨炎癥、疼痛等臨床表現(xiàn)。然而，有關(guān)粉防己及其有效成分抑制慢性炎性疼痛的具體機制尚不明確[8-9]。通過弗氏完全佐劑（Freund′s Complete Adjuvant，F(xiàn)CA）致慢性炎性疼痛小鼠模型，初步探討粉防己堿（Tetrandrine，TET）對慢性炎性疼痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用與機制，確定粉防己堿的藥效及最佳給藥時間和給藥劑量，并初步揭示粉防己堿的外周鎮(zhèn)痛機制，評價其毒性大小和耐受性，驗證粉防己堿的鎮(zhèn)痛作用與TRPV1的相關(guān)性，從局部到系統(tǒng)、形態(tài)到功能進(jìn)行研究，以明確粉防己堿的慢性炎性疼痛干預(yù)作用途徑和靶點[10-12]。本研究通過FCA致慢性炎性疼痛小鼠模型探討粉防己堿在慢性炎性疼痛中的鎮(zhèn)痛作用及其TRPV1敏化調(diào)控途徑機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取美國癌癥研究所（Institute of Cancer Research，ICR）小鼠60只，8～10周齡，體質(zhì)量（20～30 g），解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（軍）2016-0004，飼養(yǎng)環(huán)境：無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）級，溫度（24±2）℃，濕度（50±10）%，光照周期6：00～18：00，12 h晝夜交替。

1.1.2 藥物 粉防己堿（純度大于98%，材料和生物制品研究所，貨號：17011）。

1.1.3 試劑與儀器 弗氏完全佐劑（Chondrex公司，美國，貨號：7001），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（Invitrogen公司，美國，貨號：87294），TRPV1多克隆抗體（Alomone Labs公司，以色列，貨號：65296），MTT檢測試劑盒（北京榮京生物科技有限公司，貨號：34008），熱測痛儀（Ugo Basile Sri公司，意大利，型號：37360），智能熱板儀（Ugo Basile Sri公司，意大利，型號：35100），機械爪觸覺測試儀（Ugo Basile Sri公司，意大利，型號：37450），熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國，型號：CFX96）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將ICR小鼠分為6組，每組10只：正常組，正常+TET高劑量組（1.2 g/kg），F(xiàn)CA組，F(xiàn)CA+TET低、中、高劑量組（0.3、0.6、1.2 g/kg）。于FCA+TET低、中、高劑量組和FCA組小鼠右后足底皮下，取1 mL注射器緩慢注射20 μL FCA溶液，2 d后，與正常組比較小鼠行為活動明顯減少，與小鼠左后足比較，右后足出現(xiàn)明顯紅腫，表明造模成功。取1 mL注射器將正常+TET高劑量組和正常組小鼠右后足底皮下緩慢注射20 μL吐溫-80（Tween-80）溶液，2 d后，正常+TET高劑量組與正常組比較小鼠行為活動未有差異，與小鼠左后足比較，正常+TET高劑量組和正常組小鼠右后足沒有出現(xiàn)明顯紅腫。

1.2.2 給藥方法 正常組和FCA組按容積為10 mL/kg，灌胃雙蒸水，連續(xù)灌胃7 d，正常+TET高劑量組和FCA+TET低、中、高劑量組按給藥容積10 mL/kg分別灌胃各劑量的TET，連續(xù)灌胃給藥7 d，并相應(yīng)地進(jìn)行機械刺激和熱輻射痛闡測定。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法

1.2.3.1 機械刺激痛閾值測定 將實驗動物小鼠放置于機械測痛儀中金屬網(wǎng)上，蓋上有機玻璃透明分格罩，先讓小鼠適應(yīng)10～20 min，待小鼠安靜下來及其活動明顯減少或者消失后，用von Frey機械刺激針（0.04～2 g）垂直刺激小鼠右后腳掌中部，使刺激針成90°彎曲并維持2～4 s，觀察小鼠刺激足反應(yīng)情況，若小鼠在刺激時間內(nèi)沒有彈足、縮足、舔足活動反應(yīng)則記為陰性;若小鼠在刺激時間內(nèi)出現(xiàn)迅速的彈足、縮足、舔足活動則記為陽性反應(yīng)，分別于連續(xù)灌胃第1天的0、l、2、3、4、24 h及灌胃的3、5、7 d給藥1 h后測定機械刺激痛閾值。

1.2.3.2 熱輻射痛閾值測定 取ICR小鼠，分組同上，正常組及模型組小鼠灌胃給予雙蒸水，各給藥組小鼠灌胃給予相應(yīng)劑量的TET。將小鼠置于熱輻射測痛儀中適應(yīng)10～20 min，待小鼠活動明顯減少或者消失安靜后灌胃給藥，1 h后，用紅外輻射熱源對準(zhǔn)小鼠右后足底中部，記錄從照射開始到引起右后足彈足、縮足、舔足的潛伏時間。將小鼠的基礎(chǔ)熱輻射潛伏時間調(diào)整為9～12 s，將20 s（超過20 s按20 s計）作為小鼠最大潛伏時間，以防止小鼠足組織損傷，并分別在小鼠連續(xù)灌胃雙蒸水或者TET（0.34～1.35 g/kg）2、4、6 d的1 h后測定熱輻射潛伏時間。每只小鼠每隔5 s測定一次熱輻射潛伏時間，測定3次，以3次測定的平均潛伏時間作為該小鼠最終測定的實驗結(jié)果。

1.2.3.3 熱板實驗 熱板儀預(yù)先加熱至45 ℃，將各組雌性小鼠放入熱板檢測儀中，從放入開始至小鼠腫脹足出現(xiàn)舔足、彈足的時間作為熱板潛伏時間，為防止出現(xiàn)小鼠組織損傷，潛伏時間不宜超過20 s。

1.2.6 實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western Blotting，WB）在TET給藥15 d后，將小鼠乙醚麻醉處死。對受傷后爪皮膚的足底表面進(jìn)行解剖，并將其保存于-80 ℃待Real-time PCR和WB分析，Real-time PCR和WB測定TRPV1在后爪組織和小鼠背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)。使用了以下抗體：TRPV1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH），以山羊抗兔抗體與辣根過氧化物酶（1∶5 000）結(jié)合為第二抗體。對照GAPDH對TRPV1蛋白水平進(jìn)行歸一化處理，所有實驗重復(fù)4次。檢測小鼠傷害性感覺神經(jīng)末梢及背根神經(jīng)節(jié)TRPV1蛋白的表達(dá)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 釆用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差不齊性采用秩和檢驗，方差齊性采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠機械痛閾值的影響 FCA誘導(dǎo)的慢性炎性疼痛模型組與正常組比較，小鼠機械痛閾值連續(xù)7 d均表現(xiàn)顯著降低（P<0.001）;小鼠灌胃粉防己堿各組（5、15、45、60 mg/kg）與模型組比較，呈劑量依賴性地提高FCA誘導(dǎo)小鼠的機械痛閾值（P<0.05），從灌胃后0～1 h，小鼠機械痛閾值呈上升趨勢，給予粉防己堿后1 h時的鎮(zhèn)痛作用最強，從灌胃1 h之后，小鼠機械痛閾值呈下降趨勢，同時低劑量組在給藥1.5 h后粉防己堿的藥效消失，中劑量組粉防己堿的鎮(zhèn)痛作用能持續(xù)3 h（P<0.05），高劑量組粉防己堿的鎮(zhèn)痛作用能持續(xù)4 h（P<0.05）。粉防己堿連續(xù)給藥7 d，各劑量組對小鼠機械痛閾值的提高在第7天與第1天趨勢相似。見圖1。此外，粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠治療7 d后不會引起明顯的體質(zhì)量變化。見圖2。

2.2 粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠熱輻射潛伏時間的影響 FCA連續(xù)誘導(dǎo)2、4、6 d模型組與正常組比較，熱輻射潛伏時間均顯著降低（P<0.001），且熱輻射潛伏時間均穩(wěn)定在4 s上下，該模型穩(wěn)定且持續(xù)時間長。與模型組比較，粉防己堿連續(xù)給藥2、4、6 d，粉防己堿各劑量組（5、15、45、60 mg/kg）的熱輻射潛伏時間比模型組均顯著升高（P<0.05），且隨著劑量的增大而顯著升高，同時粉防己堿連續(xù)給藥的2、4、6 d的鎮(zhèn)痛作用相似，與機械痛閾值的測定結(jié)果一致。見圖3。

2.3 粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠熱板痛閾值的影響 與模型組比較，TET能明顯升高小鼠的熱板痛閾值（P<0.05）;與正常組比較，F(xiàn)CA誘導(dǎo)模型組熱板潛伏時間顯著減少（P<0.001）。見圖4。

2.4 粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠TRPV1表達(dá)的影響 在FCA誘導(dǎo)的小鼠受傷爪子的背根神經(jīng)節(jié)和皮膚中，由于TRP通道的過度表達(dá)與炎癥超敏反應(yīng)相關(guān)，因此在FCA誘導(dǎo)的小鼠中進(jìn)一步檢測了TRPV1的蛋白表達(dá)。Real-time PCR和WB分析發(fā)現(xiàn)，粉防己堿（5、15、45 mg/kg）治療以劑量相關(guān)的方式顯著降低了FCA誘導(dǎo)的炎癥后損傷爪皮膚中TRPV1的產(chǎn)生。見圖5。

3 討論

粉防己堿始載于我國《神農(nóng)本草經(jīng)》，廣泛分布于湖南、廣東、安徽等南方地區(qū)，作為我國傳統(tǒng)的中藥材，多用于慢性炎性疼痛的治療。目前有關(guān)粉防己堿抗炎鎮(zhèn)痛作用的機制研究主要認(rèn)為是抑制一氧化氮（NO），腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α），白細(xì)胞介素-6（Interleukin，IL-6）等炎癥介質(zhì)的釋放及降低核因子κB的活化或抑制IKKb/IκB/NF-κB通路[13]。研究報道，粉防己堿能通過降低體內(nèi)鈣離子水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，然而，有關(guān)粉防己堿抑制FCA致小鼠慢性炎性疼痛及機制尚未見明確報道。因此利用FCA誘導(dǎo)建立小鼠痛覺增敏模型觀察粉防己堿對痛覺增敏有無鎮(zhèn)痛作用，初步探討其鎮(zhèn)痛機制。

根據(jù)前期實驗室與臨床研究得知，粉防己堿具有抗炎鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)特點，結(jié)合外周炎癥介質(zhì)—TRPV1敏化調(diào)節(jié)途徑，我們推測粉防己堿能通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放降低TRPV1敏化從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[14-15]。

FCA致痛模型是研究炎性疼痛較理想的動物模型之一[16]，作為慢性炎性疼痛的經(jīng)典模型，小鼠足底注射FCA建立FCA致慢性炎性疼痛模型疼痛持續(xù)時間長，可達(dá)3周以上且穩(wěn)定，該模型主要廣泛應(yīng)用于緩解慢性炎性疼痛鎮(zhèn)痛藥物研究中對機械刺激和熱敏刺激敏感的測定，通過該模型給予灌胃TET，發(fā)現(xiàn)TET在不影響正常小鼠基礎(chǔ)機械痛閾值的同時能有效提高FCA小鼠機械痛閾值，同時TET還能明顯提高炎癥狀態(tài)下小鼠的熱敏刺激痛閾值。研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，正常小鼠給予粉防己堿組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，粉防己堿對于FCA致慢性疼痛模型沒有耐藥性，說明粉防己堿只對病理狀態(tài)機體發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[17-18]。眾所周知，耐受性和其他不良反應(yīng)，如體質(zhì)量減輕和胃黏膜潰瘍等，限制了目前臨床鎮(zhèn)痛藥物的使用。上述研究結(jié)果顯示粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛模型有鎮(zhèn)痛作用，且無耐受性。前期實驗顯示TRPV1拮抗劑（AMG9810）可以抑制粉防己堿提高小鼠熱板痛閾值的作用，提示TRPV1受體可能參與了粉防己堿的中樞鎮(zhèn)痛機制，同時免疫組織化學(xué)染色分析表明，F(xiàn)CA組TRPV1陽性神經(jīng)元的數(shù)量與對照組比較顯著增加，而口服粉防己堿降低了這些陽性神經(jīng)元的百分比。本研究進(jìn)一步探討確定了粉防己堿對FCA致慢性炎性疼痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用與其傷害性感受器末端和背根神經(jīng)節(jié)TRPV1蛋白表達(dá)相關(guān)性，前期研究報道炎癥介質(zhì)能促進(jìn)TRPV1的敏化，該結(jié)果可以說明粉防己堿可能通過減少外周相應(yīng)炎癥介質(zhì)的釋放從而降低傷害性感覺神經(jīng)末梢和背根神經(jīng)節(jié)中TRPV1 mRNA及TRPV1蛋白表達(dá)而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[19-20]。

綜上所述，本實驗證明了粉防己堿呈劑量依賴性的抑制FCA致痛模型，其對慢性炎性疼痛的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與抑制TRPV1的表達(dá)有關(guān)，鑒于慢性炎性疼痛發(fā)病機制的復(fù)雜性及粉防己多方面的藥理活性作用特點，本研究對指導(dǎo)臨床合理用藥及進(jìn)一步研發(fā)高效低毒的新型多靶點鎮(zhèn)痛藥物具重要意義，也為揭示中醫(yī)藥功效作用和拓展運用提供更可靠的理論和實驗依據(jù)。

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（2020-07-22收稿 本文編輯：王明）