黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠AMPK-mTOR通路的調(diào)控機制研究

葉婷 馬國慶 魏明慧 陳晶

摘要 目的：研究黃芪多糖對糖尿病心肌病（DCM）大鼠的干預(yù)作用，闡明黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠心肌AMPK-mTOR信號通路的影響，探討黃芪多糖對糖尿病心肌病大鼠心肌的保護作用。方法：80只健康雄性SD大鼠，隨機選取10只作為對照組，其余70只采用高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素腹腔注射復(fù)制DCM模型。將模型復(fù)制成功的大鼠隨機分為模型組、黃芪多糖組、氯喹組、黃芪多糖+氯喹組。連續(xù)給藥8周后，超聲心動圖評價大鼠的心臟功能，HE染色觀察心肌組織的病理變化，Masson染色檢測大鼠心肌纖維化程度，蛋白質(zhì)印跡法測定心肌組織中AMP活化蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR蛋白的表達，實時PCR檢測心肌組織AMPK、mTOR mRNA的表達情況。結(jié)果：與對照組比較，模型組大鼠左室收縮末內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末內(nèi)徑（LVEDD）、mTOR蛋白、p-mTOR蛋白、mTOR mRNA明顯升高，左心室射血分數(shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS）、AMPK、p-AMPK、AMPK mRNA明顯降低（均P<0.01）。與模型組比較，黃芪多糖組組LVEDD、LVESD、mTOR蛋白、p-mTOR蛋白明顯降低，LVEF、LVFS、AMPK蛋白、p-AMPK蛋白明顯升高（均P<0.01）。與黃芪多糖組比較，黃芪多糖組+CQ組大鼠心肌p-AMPK蛋白、AMPK mRNA水平明顯降低，mTOR、p-mTOR、mTOR mRNA水平明顯升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：黃芪多糖能調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號通路上相關(guān)蛋白及的mRNA表達，激活A(yù)MPK-mTOR信號通路，進而發(fā)揮對糖尿病心肌病的保護作用。

關(guān)鍵詞 黃芪多糖;鏈脲佐菌素;糖尿病心肌病;糖脂代謝;心肌肥厚;AMP活化蛋白激酶;哺乳動物雷帕霉素靶蛋白;信號通路

Regulation Mechanism of Astragalus Polysaccharides on Diabetic Cardiomyopathy Rats by AMPK-mTOR Pathway

YE Ting1，MA Guoqing1，WEI Minghui1，CHEN Jing2

（1 The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150001，China; 2 Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Abstract Objective：To study the effect of astragalus polysaccharides（APS） on diabetic cardiomyopathy（DCM） rats，clarify the effect of APS on AMPK-mTOR signaling pathway in DCM rats，and explore the protective effect of APS on DCM rats.Methods：A total of 80 healthy male SD rats were selected.Ten of the rats were randomly divided into a control group.The other 70 rats were fed with high-sugar and high-fat diet，and intraperitoneally injected streptozotocin（STZ） to induce and duplicate DCM model.The rats with DCM model were randomly divided into a model group，an APS group，a chloroquine group，and an APS+chloroquine group.After treatment for 8 weeks，echocardiography was used to evaluate the cardiac function of rats，and hematoxylin-eosin（HE） staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissue.Masson staining was used to detect the degree of myocardial fibrosis，and Western blot was used to detect the protein expressions of adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase（AMPK），phosphorylated-AMPK（p-AMPK），mammalian target of rapamycin（mTOR），and phosphorylated-mTOR（p-mTOR），and real-time quantitative polymerase chain reaction（real-time PCR） was used to detect the messenger ribonucleic acid（mRNA） expressions of AMPK and mTOR.Results：Compared to the control group，left ventricular end diastolic dimension（LVEDD），left ventricular end systolic diameter（LVESD），proteins of mTOR and p-mTOR，and mRNA of mTOR in the model group were significantly increased，while left ventricular ejective fraction（LVEF），left ventricular fraction shortening（LVFS），proteins of AMPK and p-AMPK，and mRNA of AMPK were significantly decreased（P<0.01）.Compared with the model group，LVEDD，LVESD，proteins of mTOR and p-mTOR in the APS group were significantly decreased，while LVEF，LVFS，proteins of AMPK and p-AMPK were significantly increased（P<0.01）.Compared with the APS group，protein of p-AMPK and mRNA of AMPK in the APS+chloroquine group were significantly decreased，while proteins of mTOR，p-mTOR and mRNA of mTOR were significantly increased（P<0.05，P<0.01）.Conclusion：APS regulated the expression of related proteins and mRNA in AMPK-mTOR signaling pathway，and activated AMPK-mTOR signaling pathway，thus playing a protective role in DCM.

Keywords Astragalus polysaccharides; Streptozotocin; Diabetic cardiomyopathy; Glycometabolism; Cardiac hypertrophy; Adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase; Mammalian target of rapamycin; Signaling pathway

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.014

糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是臨床中糖尿病最為常見的并發(fā)癥之一，主要是指發(fā)生于糖尿病病患，而不依賴于高血壓心臟病、瓣膜性心臟病、冠心病及其他心臟病變來解釋的心肌疾病[1-2]。其發(fā)病率高，危險性大，是糖尿病患者主要死亡原因之一[3]。DCM的發(fā)病機制是在代謝紊亂、微血管病變基礎(chǔ)上引起心肌微血管損傷、血管周圍及間質(zhì)發(fā)生纖維化等病理學改變，從而出現(xiàn)亞臨床心功能異常，最終進展為心律失常、心源性休克及心力衰竭，重癥患者甚至猝死[4]。腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMP-actived Protein Kinase，AMPK）是重要的“能量調(diào)節(jié)器”，主要作用是感受細胞能量狀態(tài)的變化，當機體內(nèi)出現(xiàn)缺血、缺氧以及氧化應(yīng)激時，AMPK則會被激活[5]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是AMPK下游的重要信號分子，是調(diào)節(jié)自噬的關(guān)鍵蛋白，激活的AMPK能抑制mTOR，進而調(diào)節(jié)自噬[6]。對糖尿病心肌病動物模型進行觀察[7]，發(fā)現(xiàn)自噬被抑制，說明自噬的抑制將導致糖尿病心肌病[8]，而抑制AMPK，mTOR被激活，輕鏈3（Light Chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）表達增強，將激活自噬[9]。相關(guān)研究已證實黃芪多糖（Astragalus Polysaccharides，APS）對糖尿病及其并發(fā)癥均有防治作用，能降低血糖、血脂等指標水平，增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)心肌能量代謝，減輕心肌組織損傷，可抑制心肌細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）積聚和心肌纖維化，恢復(fù)心肌功能，減輕大鼠心肌損傷[10]。綜上所述，AMPK-mTOR在DCM中起重要作用，但黃芪多糖是否通過AMPK-mTOR介導發(fā)揮對DCM模型大鼠心肌損傷的調(diào)節(jié)作用尚不明確。為此，本實驗用SD大鼠復(fù)制DCM模型，設(shè)計實驗觀察黃芪多糖組對DCM模型大鼠AMPK-mTOR信號通路的影響，從糖脂代謝、心臟功能、病理學形態(tài)、分子蛋白水平探討黃芪多糖組治療DCM的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性6周齡Sprauge-Dawley（SD）大鼠80只，體質(zhì)量（180±20）g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（黑）2016-004。實驗室的室內(nèi)溫度為（22±2）℃，相對濕度（55±10）%，自然采光，大鼠飼養(yǎng)在動物籠內(nèi)，墊料為清潔木屑，以大鼠標準飼料進行喂養(yǎng)，自由飲食及飲水。實驗方案經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物管理和使用委員會批準（倫理審批號：2018092601）。

1.1.2 藥物 黃芪多糖（西安瑞林生物科技有限公司，批號：RL20150412）;氯喹（Sigma公司，美國，批號：C6628-25G）;鏈脲佐菌素（Streptozocin，STZ，Sigma公司，美國，批號：S0130-1g）。

1.1.3 試劑與儀器 AMPK抗體（貨號：ab131512）、p-AMPK抗體（貨號：ab23875）、mTOR抗體（貨號：ab32028）、p-mTOR抗體（貨號：ab109268），以上均購自英國Abcam公司。電子天平（METTLEY TOLEDO公司，瑞士，型號：AL204），超聲顯像儀（SIEMENS公司，德國，型號：SEQUOIA512），酶標儀（Bio-Rad公司，美國，型號：iMark），低溫離心機（Thermo公司，美國，型號：ST8）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將80只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為對照組，其余70只給予高糖高脂飼料（基礎(chǔ)料66.6%、蔗糖20%、豬油10%、膽固醇2.5%、膽酸鈉1%;脂肪含量比35%，總熱3.95 kcal/g）喂養(yǎng)4周后，按30 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射鏈脲佐菌素（0.1%檸檬酸緩沖液，pH4.5）。1周后尾部取血測空腹血糖（大于16.7 mmol/L），并出現(xiàn)多飲、多尿癥狀視為2型糖尿病模型造模成功。糖尿病模型制備成功后，繼續(xù)飼養(yǎng)8周后，隨機選取2只大鼠處死，進行心肌組織的蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and Eosin Staining，HE staining）及透射電鏡，如心肌細胞出現(xiàn)排列紊亂、細胞肥大、線粒體腫脹等變化，則說明其出現(xiàn)心肌損傷，表明DCM大鼠模型復(fù)制成功[11-12]。將DCM大鼠隨機分為4組：模型組、黃芪多糖組、氯喹組、黃芪多糖+氯喹組。

1.2.2 給藥方法 分組后對各組大鼠灌胃給藥，給藥量按人與大鼠給藥劑量系數(shù)折算公式，同時參考相關(guān)文獻[13]，具體給藥劑量如下：黃芪多糖組按照800 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥黃芪多糖;氯喹組按照25 mg/（kg·d）劑量腹腔注射氯喹;黃芪多糖+氯喹組同時給予800 mg/（kg·d）劑量灌胃給藥黃芪多糖和25 mg/（kg·d）劑量腹腔注射氯喹;對照組等容積生理鹽水灌胃;模型組等容積生理鹽水灌胃。1次/d，共8周。實驗過程中有個別鼠因血糖過高不耐受而死亡，共剩余55只。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 超聲心動圖 造模后及治療后對各組大鼠行超聲心動圖檢查，10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后將其仰臥位固定在操作臺上，胸前備皮，利用小動物超聲儀（探頭頻率為14 MHz），沿胸骨旁左心長軸切面進行檢查，測左室收縮末內(nèi)徑（Left Ventricular End Systolic Diameter，LVESD）、左室舒張末內(nèi)徑（Left Ventricular End Diastolic Diameter，LVEDD），連續(xù)測量3個心動周期取平均值，按照Teichholtz公式計算左心室射血分數(shù)（Left Ventricular Ejection Fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（Left Ventricular Fractional Shortening，LVFS），用于評價大鼠心臟功能。

1.2.3.2 心肌組織HE染色 將心室組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片后，脫蠟、入水，蘇木精（Hematoxylin）染液染色，水洗，伊紅（Eosin）染液染色，梯度乙醇脫水，透明，中性樹脂封片，光鏡下觀察心肌病理改變情況，拍照。

1.2.3.3 心肌組織Masson染色 石蠟切片脫蠟至水，鉻化處理或去汞鹽沉淀，用Regaud蘇木精染液染核，充分水洗，用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液染色，苯胺藍復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固玻片，光鏡下觀察心肌膠原的沉積情況，拍片并記錄。

1.2.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測心肌組織AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表達 凍存的心肌組織，提取總蛋白和細胞核蛋白。取50 μg蛋白進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳結(jié)束后以200 mA恒流，90 min為轉(zhuǎn)膜條件將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidenefluoride，PVDF）上，室溫封閉2 h后，加入5%牛血清白蛋白以稀釋抗體，4 ℃孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷緩沖液（Tris-buffered Saline，TBS）+吐溫（Tween）緩沖溶液洗膜4次，15 min/次，二抗稀釋液室溫孵育1 h，TBS+Tween緩沖溶液（TBST）洗膜4次，15 min/次，用ECL化學發(fā)光顯色液，避光顯影2 min，置于全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描，檢測AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表達情況。

1.2.3.5 實時聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測心肌組織AMPK、mTOR的表達 50 mg心肌組織放置1.5 mL的EP管中，加入TRIzol Reagent試劑（TRIzol），提取1 μL RNA，核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度。取出10 μLRNA樣本加到200 μL的PCR管中，將RNA反轉(zhuǎn)錄至cDNA，測量cDNA濃度。PCR管中分別加入cDNA模板及上下游引物，PCR儀設(shè)置好程序，進行PCR擴增，采用2-△△Ct法分析基因表達相對變化，整理并導出數(shù)據(jù)。Real-time PCR引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，所有計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。組間比較用單因素方差分析和配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖對DCM大鼠超聲心動圖檢查結(jié)果的影響 治療后，與對照組比較，模型組大鼠LVEDD、LVESD明顯升高，LVEF、LVFS明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與模型組比較，黃芪多糖組LVEDD、LVESD明顯降低，LVEF明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表2，圖1。

2.2 黃芪多糖對DCM大鼠心肌組織病理學的影響? 大鼠心肌組織切片HE染色結(jié)果顯示，對照組心肌細胞排列整齊，無水腫、壞死等形態(tài)學改變，肌纖維排列緊密，橫紋清晰可見，無炎癥細胞浸潤。而模型組可見心肌細胞肥大，排列紊亂，有肌纖維斷裂、溶解、壞死等情況，有大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，黃芪多糖組、黃芪多糖+氯喹組雖然鏡下仍可見病理學改變，但心肌細胞排列相對整齊，肌纖維結(jié)構(gòu)較清晰，炎癥細胞浸潤程度有改善。氯喹組心肌細胞肥大，排列紊亂，肌纖維斷裂、溶解、壞死，炎癥細胞浸潤較模型組加重。大鼠心肌組織切片Masson染色顯示，對照組大鼠心肌細胞、血管之間可見少量膠原纖維;模型組可見明顯的心肌細胞肥大、膠原纖維增生、排列紊亂、間質(zhì)纖維化明顯，圖片中可見分布不均、相互連接形成網(wǎng)狀的膠原纖維;與模型組比較，黃芪多糖組、黃芪多糖+氯喹組心肌膠原纖維增生減輕，細胞形態(tài)尚可。氯喹組心肌纖維化程度較模型組加重。見圖2。

2.3 黃芪多糖對DCM大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白表達的影響 治療后，與對照組比較，模型組大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與對照組比較，黃芪多糖組、黃芪多糖+氯喹組大鼠心肌AMPK、p-AMPK蛋白的水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+氯喹組大鼠心肌p-AMPK蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3，圖3。

2.5 黃芪多糖對DCM大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白表達的影響 治療后，與對照組比較，模型組大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與模型組比較，黃芪多糖組大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白的水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+氯喹組大鼠心肌mTOR、p-mTOR蛋白水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。見表4，圖4。

2.6 黃芪多糖對DCM大鼠心肌AMPK、mTOR mRNA表達的影響 治療后，與對照組比較，模型組大鼠心肌AMPK mRNA表達水平明顯降低，而mTOR mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。與模型組比較，黃芪多糖組、黃芪多糖+氯喹組大鼠心肌AMPK mRNA表達水平明顯升高，而mTOR mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+氯喹組大鼠心肌AMPK mRNA表達水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5，圖5。

3 討論

DCM目前的治療主要從控制危險因素（強化降糖、降脂、降壓）和抑制心臟重構(gòu)2方面進行，預(yù)防心力衰竭進展和惡化[14]，但數(shù)據(jù)表明糖尿病患者的心血管事件發(fā)生進程并沒有完全減少[15]。黃芪多糖是黃芪的主要活性成分之一，近年研究發(fā)現(xiàn)，其在調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、延緩衰老等方面有較好的療效[16-17]。相關(guān)研究已證實黃芪多糖對糖尿病及其并發(fā)癥均有良好的防治作用，能增加胰島素敏感性，調(diào)節(jié)心肌能量代謝，減輕心肌組織損傷，可抑制ECM積聚和心肌纖維化，恢復(fù)心功能，減輕大鼠心肌損傷等[18-20]。黃芪多糖干預(yù)心力衰竭小鼠模型表明，黃芪多糖能通過降低AMPK蛋白表達，增加mTOR表達，調(diào)節(jié)AMPK-mTOR通路，減輕阿霉素誘導的小鼠心力衰竭[21]。

本研究彩色多普勒超聲結(jié)果顯示：與對照組比較，模型組大鼠的LVEDD、LVESD水平明顯升高，LVEF、LVFS明顯降低（均P<0.05），提示模型組大鼠未經(jīng)藥物干預(yù)，心臟功能存在明顯改變，符合DCM的典型超聲心動圖特點。與模型組比較，黃芪多糖組組LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高（均P<0.01），提示經(jīng)黃芪多糖治療后，DCM大鼠的心功能得到一定程度的改善。同時，實驗結(jié)果表明，應(yīng)用氯喹后，LVEDD、LVESD較模型組升高，LVEF、LVFS較模型組降低，說明氯喹對DCM大鼠的心功能有一定程度的影響。與黃芪多糖組比較，黃芪多糖+氯喹組LVEDD、LVESD降低，LVEF、LVFS升高，提示氯喹有部分抑制黃芪多糖改善心功能的作用，氯喹的應(yīng)用能影響大鼠的心功能指標，影響黃芪多糖對心功能的改善作用。

本實驗通過HE染色觀察DCM大鼠心肌組織形態(tài)變化，Masson 3色染色，觀察心肌間質(zhì)內(nèi)膠原纖維的沉積情況。光鏡下可見模型組大鼠心肌細胞肥大，排列紊亂，有肌纖維斷裂、溶解、壞死等情況，有大量炎癥細胞浸潤。Masson染色提示心肌細胞肥大，肌纖維排列紊亂，纖維化組織替代正常心肌組織，心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增加，藍染的纖維結(jié)締組織將心肌肌束分隔包繞，提示DCM模型大鼠心肌組織發(fā)生嚴重損傷，且有纖維化發(fā)生。黃芪多糖和氯喹干預(yù)后，雖然鏡下仍可見病理學改變，但心肌細胞排列相對整齊，肌纖維結(jié)構(gòu)較清晰，炎癥細胞浸潤程度有改善，心肌細胞形態(tài)與肌纖維排列明顯改善，其中黃芪多糖組改善最為明顯，提示黃芪多糖能改善DCM大鼠心肌病理學變化，且黃芪多糖對DCM大鼠心肌保護作用可以被氯喹部分抑制。

本實驗采用蛋白質(zhì)印跡法檢測心肌組織AMPK-mTOR通路上AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)DCM時，AMPK受到抑制，p-AMPK蛋白表達水平降低，mTOR被激活，p-mTOR蛋白表達水平升高，提示DCM時，AMPK-mTOR信號通路被抑制;黃芪多糖和氯喹應(yīng)用后，AMPK、p-AMPK的蛋白表達水平均有不同程度提高，mTOR、p-mTOR蛋白的表達水平下降，提示黃芪多糖能促進AMPK-mTOR信號通路的激活。Real-time PCR檢測心肌組織AMPK、mTOR的mRNA表達，模型組AMPK mRNA降低、mTOR mRNA升高，黃芪多糖和氯喹干預(yù)后，大鼠心肌組織中AMPK mRNA的水平均有不同程度的提高，而mTOR mRNA的水平降低，提示黃芪多糖能調(diào)節(jié)DCM大鼠AMPK-mTOR信號通路，氯喹可部分抑制黃芪多糖組對AMPK-mTOR信號通路的影響。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果顯示，黃芪多糖能調(diào)節(jié)AMPK-mTOR信號通路上相關(guān)蛋白的mRNA表達，激活A(yù)MPK-mTOR信號通路，進而發(fā)揮對DCM的保護作用。然而，黃芪多糖是否通過其他的信號通路改善DCM發(fā)揮作用仍有待進一步探索。明確其在DCM中的具體作用機制，將為黃芪多糖的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時也為DCM的臨床治療提供新的思路。

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（2021-03-23收稿 本文編輯：張樂杰）