香糟大鯢冷凍調理制品工藝優化及滋味評價

馬東林，郭全友，李保國，馮廣朋，楊絮，王海華，姜朝軍，馬本賀

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090)2(上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海，200093) 3(江西省水產科學研究所，江西 南昌，330039)

大鯢(Andriasdavidianus)作為經濟價值較高的冷水兩棲動物，營養美味，肌肉中必需氨基酸種類齊全，脂肪中富含多不飽和脂肪酸、DHA等，皮膚中含有膠原蛋白及明膠，享有“水中人參”的美譽[1-2]。人工育種技術的突破及工廠化養殖和仿生態養殖技術的完善，促進了大鯢養殖產業的迅猛發展[3]。大鯢作為張家界的特色動物資源養殖規模已達200萬尾[4]。但養殖大鯢多以鮮活個體出售，提高了消費門檻，并且大鯢加工產品較為單一，多為保健品，阻礙了大鯢產業的發展[1]。冷凍調理制品具有食用方便、風味多樣和便于銷售等特點，符合天然、便利、健康和美味等消費需求。

紅糟作為世界最古老的發酵型酒精飲料之一的紅曲黃酒的酒糟，香氣獨特，且富含天然紅色素，具有降低血脂、降血壓、抗突變、抗疲勞等生理活性[5-6]。余睿智[7]在葡萄酒發酵過程中加入大鯢低聚糖肽，發現添加大鯢低聚糖肽的葡萄酒香氣物質顯著增加，其中大鯢低聚糖肽葡萄酒中苯乙醇的含量是不加大鯢低聚糖肽獲得的葡萄酒中含量的2.68倍。隨著經濟的發展和生活節奏的加快，為了節省時間，越來越多的消費者更傾向于選擇便捷的冷凍調理食品。鄧立青[8]以變性淀粉、小麥粉、食鹽等作為輔料，制備的魷魚冷凍調理制品香氣誘人、質地爽脆。結合大鯢品質特色和現有糟魚技術，開發具有大鯢特色的精深加工產品，可開拓大鯢消費市場。

本文以大鯢為研究對象，通過響應面分析法優化香糟大鯢調理加工工藝參數，重點評價腌制工藝對產品品質及滋味物質的影響，以期為香糟大鯢冷凍調理制品的開發提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鯢，金鯢農業生物科技有限公司提供。大鯢宰殺放血、燙漂去除黏液后，放入-18 ℃冰箱預冷至0 ℃左右，冷鏈運至實驗室后低溫凍藏(-80 ℃)；香辛料(姜、桂皮、小茴香、陳皮、丁香、草果、山奈、花椒、羅漢果、朝天椒、香茅草等)，內江菜市場；調味料(蔥、姜、蒜、白糖、鹽、味精、生抽、白酒、豬骨白湯等)，歐尚超市；紅糟，寧德市蔡氏水產有限公司。

氯化鈉、氫氧化鈉、高氯酸、甲基紅、亞甲基藍、酚酞、鉻酸鉀、硝酸銀、0.01 mol/L鹽酸、乙醚、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸等(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；正庚烷、氨基酸標準品、核苷酸標準品(色譜純)，Sigma公司。

1.2 儀器與設備

KDN-103F定氮儀、SZCD脂肪測定儀，上海纖檢儀器有限公司；TMS-Pro質構儀，美國Food Technology Corporation公司；HI2216pH計，哈納沃德儀器(北京)有限公司；PMB35水分含量測定儀，英國艾德姆衡器公司；Chroma Meter CR400色差計，日本Minolta公司；DZ400S真空包裝機，上海帆銘機械有限公司；L28500氨基酸自動分析儀，日本日立公司；1100液相色譜，美國 Agilent公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 香糟大鯢加工工藝流程

工藝流程：將-80 ℃下保存的大鯢進行流水解凍，清洗后去骨、分塊(約3 cm寬)，加入一定量的鹽、生姜、生抽和白酒等放入5 ℃下24 h預腌去腥，加入一定比例的冷卻至室溫的鹵湯和其他調味料(紅糟、鹽、白糖、料酒、生抽、味精、豬骨白湯等)，放入密封袋后封口，置于4 ℃溫度下腌制3 d入味，腌制結束后去除腌制料，將魚塊真空密封，放入-18 ℃下凍藏。

鹵湯制備：稱取一定量的干姜、桂皮、小茴香、陳皮、丁香、草果、山奈、花椒、羅漢果、朝天椒和香茅草等，加入50～60 ℃水浸泡30 min去灰除腥，過濾，再按質量百分比加入水，煮沸后小火煮30 min，獲得鹵湯。

冷凍調理過程針對危害分析與關鍵控制點(hazard analysis critical control point，HACCP)中關鍵控制點，腌制入味環節不僅影響風味的形成，也改變產品質構和保水性，故針對腌制環節進行單因素和多因素優化。腌制結束去除腌制料后進行感官評分、鹽分、水分含量、水分活度、pH、揮發性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)、脂肪、蛋白質及肌肉彈性等指標的測定；將-18 ℃凍藏的香糟大鯢調理制品流水解凍，肌肉攪拌成肉糜后進行游離氨基酸和呈味核苷酸的測定。

1.3.2 感官評定

參考文獻[9]選取10名具有食品感官評定知識人員，進行大鯢及紅糟審評標準及審評方法的培訓，分別對產品的外觀、氣味、滋味、口感4個指標進行感官評價。感官評價標準見表1，感官評分結果按照外觀、氣味、滋味、口感分別占0.2、0.2、0.35、0.25的權重計算分值[10-11]。

表1 大鯢調理制品的感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of prepared products of giant salamander

1.3.3 鹽分測定

鹽分含量參照SC/T 3011—2001《水產品中鹽分的測定》中硝酸銀沉淀滴定法進行測定。

1.3.4 理化指標的測定

水分含量按照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》測定；水分活度(water activity，Aw)按照GB 5009.238—2016《食品安全國家標準 食品水分活度的測定》中的第二法水分活度儀擴散法進行測定；pH值按照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》進行測定；TVB-N含量按照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》進行測定；脂肪和蛋白質含量分別參照GB 5009.6—2016和GB 5009.5—2016進行測定。

1.3.5 游離氨基酸的測定

參考CHEN等[12]和周紛等[13]的方法并略有改動，稱取樣品4.0 g(精確到0.001 g)，加入30 mL三氯乙酸溶液(質量分數5%)并進行勻漿，超聲5 min后室溫靜置2 h，10 000 r/min離心(4 ℃)10 min，吸取20 mL 上清液于燒杯中，用6 mol/L NaOH溶液和1 mol/L NaOH溶液調節pH值至2.0，最后用超純水定容至50 mL，用0.22 μm水相濾膜過濾后打入進樣瓶待上機測定。

測試參數設定：分離柱(4.6 mm×60 mm)，樹脂為陽離子交換樹脂；分離柱溫度57 ℃；1通道流速0.4 mL/min；2通道流速0.35 mL/min；流動相：pH 3.2、3.3、4.0、4.9的檸檬酸鈉和檸檬酸的混合緩沖液以及質量分數4%的茚三酮緩沖液。

1.3.6 呈味核苷酸測定

參考周紛等[13]的方法并略有改動。稱取樣品10.0 g(精確到0.001 g)，加入20 mL高氯酸溶液(質量分數10%，4 ℃預冷)，勻漿后超聲5 min，10 000 r/min離心(4 ℃)15 min后取上清液，向沉淀中加入用10 mL 高氯酸溶液(質量分數5%，4 ℃預冷)，再次離心取上清液，合并2次上清液，用6 mol/L的KOH溶液調節pH值至5.8，靜置30 min后取上清液定容至100 mL，搖勻后用水相0.22 μm的濾膜打入進樣瓶，待上機測定，整個過程均在0～4 ℃條件下操作。

測試參數設定：ODS-3色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：A為甲醇溶液，B為0.02 mol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀溶液，用磷酸調至pH值為6.5，等梯度洗脫；流速1 mL/min；柱溫28 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

1.3.7 滋味強度值計算

滋味物質的味道強度值(taste activity value，TAV)按公式(1)計算：

(1)

式中：C代表樣品中滋味物質的絕對濃度值，T代表該滋味物質的閾值，同單位下計算。

1.3.8 味精當量值的計算

味精當量(equivalent umami concentration，EUC)用于計算鮮味強度，參考WANG等[14]的計算方法，按式(2)計算：

EUC=∑aibi+1 218(∑aibi)(∑ajbj)

(2)

式中：EUC為味精當量，以單位質量大鯢肉中谷氨酸鈉(monosodium glutamate，MSG)的質量表示，g MSG/100g；ai為鮮味氨基酸的量，g/100g；bi為轉化系數(Glu，1；Asp，0.077)；aj為5’-核苷酸的量，g/100g；bj為轉換系數[肌苷酸(IMP)，1；鳥苷酸(GMP)，2.3；腺苷酸(AMP)，0.18]；協同常數為 1 218。

1.3.9 單因素實驗

為了考察各因素對香糟大鯢品質的影響，在恒定因素為加鹽量3.0%、腌制時間3 d、腌制溫度4 ℃條件下，研究加鹽量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)、腌制時間(1、2、3、4、5 d)和腌制溫度(2、4、6、8、10 ℃)對香糟大鯢調理制品的水分含量、肌肉色澤(a*值)、肌肉彈性和感官評分等指標的影響。

在香糟大鯢腌制過程中，紅糟中的紅曲色素隨著腌制進程逐漸滲透到魚肉中，使得魚肉a*值逐漸增大，因此可通過a*值判別腌制的進程，理想的a*值范圍預示著較好的腌制入味程度。魚肉彈性是魚體質構特性的重要指標之一，是肌肉對外力抵抗的體現。水分含量可影響魚肉嫩度及貯藏，故控制水分含量可改善魚肉的品質。感官評定是具有專業知識的人員運用味覺、視覺、觸覺和嗅覺等人體感覺對產品氣味、外觀、口感和滋味等進行綜合性評價的一種方法，能夠綜合反映食品的品質狀態。綜上，故選擇肌肉色澤(a*)、魚肉彈性、水分含量和感官評定為考察指標進行單因素實驗。

1.3.10 響應面法優化大鯢的調理工藝

根據單因素實驗結果，采用軟件Design-Expert設計3因素3水平的Box-Behnken試驗，研究響應值以及最佳變量的組合。表2為響應面因素水平表。

表2 響應面因素水平表Table 2 Response surface factor level table

1.3.11 數據處理

采用Excel和SPSS 25軟件進行數據統計。所有實驗檢測均作3次平行，測定結果以“x±SD”表示，對實驗數據進行方差分析，以P<0.05為顯著，P<0.01為極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 加鹽量的影響

腌制是用鹽或其他調味品滲入物料，達到入味的目的。加鹽量對糟味大鯢調理制品品質的影響如圖1所示，隨著NaCl添加量的增加，肌肉a*值逐漸增大，添加量達到3%時，大鯢魚肉的a*值達到理想值，此時肌肉彈性和感官評分達到最大值，而水分含量隨著加鹽量增加一直減少。綜合考慮彈性、色澤、水分含量和感官評分等，加鹽量3.0%為宜。

a-加鹽量對肌肉彈性和a*的影響； b-加鹽量對肌肉水分含量和感官評分的影響圖1 加鹽量對肌肉品質的影響Fig.1 The effect of salt on muscle quality

2.1.2 腌制時間的影響

腌制在魚肉內外滲透壓達到平衡時，水分和鹽離子等達到交換平衡。腌制時間對糟味大鯢調理制品品質影響如圖2所示，大鯢肌肉水分含量隨著腌制時間延長先下降后趨于平穩，在腌制3 d時達到平衡，此時感官評分達到最大值，而肌肉彈性也在3 d以后趨于平穩，肌肉a*值達到理想值。綜合考慮彈性、色澤、水分含量和感官評分等，腌制時間選擇3 d為宜。

2.1.3 腌制溫度的影響

溫度越高，離子運動越快，腌制速率越快，而溫度過高無法抑制微生物的生長，尤其雜菌的生長會影響產品品質，導致腐敗變質。因此為平衡腌制速率和產品品質，選擇合適的腌制溫度尤為重要。腌制溫度對糟味大鯢調理制品的影響如圖3所示，隨著腌制溫度的升高，大鯢肌肉水分含量逐漸降低，肌肉彈性在8 ℃ 時達到最大值，肌肉a*值隨溫度升高而增大。感官評分在4 ℃時達到最大值，隨著溫度升高，感官評分逐漸降低，然而6 ℃和8 ℃時感官評分仍高于90分。綜合考慮彈性、色澤、水分含量和感官評分等，腌制溫度選擇6 ℃為宜。

a-腌制溫度對肌肉彈性和a*的影響； b-腌制溫度對肌肉水分含量和感官評分的影響圖3 腌制溫度對肌肉品質的影響Fig.3 The effect of marinating temperature on muscle quality

2.2 響應面優化結果與分析

2.2.1 響應面試驗設計結果

選取糟味大鯢腌制過程中的加鹽量(A)、腌制溫度(B)和腌制時間(C) 3個因素為自變量，以感官評定結果(Y)為響應值進行中心組合實驗，實驗設計及結果見表3。17個實驗點中，12個析因實驗，5個中心實驗，析因點為自變量取值在A，B，C所構成的三維頂點，零點為區域的中心點，零點實驗5次，用以估計實驗誤差。

2.2.2 感官評定與腌制條件數學模型的建立

肌肉的a*值、魚肉彈性及含水量是考察糟味大鯢腌制工藝的重要指標，對不同腌制條件下的這3項指標進行測定，并對相應產品進行感官評定。對實驗數據使用Design-Expert軟件進行二次回歸擬合，得到感官評定分值與腌制條件的回歸方程：

Y=91.69-3.18A+0.14B-0.059C-2.54AB-1.75AC-0.38BC-8.95A2-2.47B2-2.11C2

表3 Box-Behnken 實驗設計及結果Table 3 Box-Behnken test design and results

通過Design-Expert軟件進行方差分析，驗證回歸模型及各參數的顯著性，結果見表4。

表4 響應面方差分析Table 4 Response surface analysis of variance

對結果進行ANOVA分析檢驗，由表4可知，感官評分的模型回歸的顯著性和可靠性極高(P<0.000 1<0.01)，失擬項不顯著(P=0.132 1>0.05)，并Design-Expert分析得出R2和校正R2分別為0.989 2、0.975 3，表明方程擬合度較高，模型高度顯著。一次項A和交互項AB、AC以及二次項A2、B2、C2具有極顯著影響，而交互項BC影響不顯著。其中各因素影響程度為A>B>C，即加鹽量>腌制溫度>腌制時間。該模型能夠較好地描述糟味大鯢調理制品加工工藝參數對其感官評分的影響。

加鹽量、腌制時間和腌制溫度交互作用對感官評定的影響見圖4。由圖4可看出，在加鹽量3.0%、腌制時間3 d和腌制溫度6 ℃的條件下，NaCl添加量與腌制時間以及腌制溫度與NaCl添加量之間的交互作用均為顯著(P<0.05)。當腌制溫度一定時，隨著加鹽量的增加，產品感官品質提高，在加鹽量達到2.90%時產品品質最佳，隨后加鹽量繼續增加，感官開始下降。隨著腌制時間的延長，感官評定分值先升高后降低，在腌制時間達到73.40 h產品品質最佳;隨著腌制溫度的升高，感官評定分值先上升后下降，在溫度為6.25 ℃時產品品質最佳。因此，只有適宜的加鹽量、腌制溫度和時間，魚肉口感才會最好。

a-加鹽量和腌制溫度對感官評定分值影響的響應曲圖；b-加鹽量 和腌制時間對感官評定分值影響的響應曲圖；c-腌制時間和腌制 溫度對感官評定分值影響的響應曲圖圖4 加鹽量、腌制時間和腌制溫度交互作用對 感官評定的影響Fig.4 The influence of the interaction of the amount of salt added, the curing time and the curing temperature on the sensory evaluation

2.3 理化性質分析

不同的腌制方式會使產品形成不同的風味，同時也會改變產品的理化特性[15]。為了研究腌制加工后大鯢營養成分和理化指標的變化，分別測定了原料大鯢和糟味大鯢調理制品的基本營養成分和理化指標，結果如表5。

由表5可知，原料大鯢與大鯢冷凍調理制品除粗蛋白和脂肪外，其他基本營養成分和理化指標均有顯著性差異(P<0.05)。原料大鯢經腌制入味后鹽分質量含量由(0.14±0.03)%上升為(3.17±0.10)%，屬于低鹽制品(鹽分<6.0%)，符合健康飲食理念，且有助于大鯢冷凍調理制品的貯藏和色澤的保持[16]。水分含量由(79.68±1.19)%降低為(71.83±2.75)%，魚肉Aw由0.992±0.001降至0.966±0.001，但大鯢冷凍調理制品水分含量和Aw仍然較高，屬于低鹽高濕制品，抑菌作用將會減弱[17]。水分含量的下降使得蛋白質和脂肪濃縮進而相對含量上升，說明營養品質得到提高[18]。腌制過程會伴隨物質的析出及蛋白質等大分子的降解，使得大鯢肌肉的pH值從6.02±0.03降低到5.61±0.04，pH值顯著降低，改善了肉質的品質。

表5 大鯢冷凍調理制品理化指標測定結果Table 5 Results of determination of physical and chemical indexes of frozen preparations of giant salamander

TVB-N含量表征魚的新鮮度和安全性。原料大鯢的TVB-N含量為(5.92±0.08) mg/100g(≤13 mg/100g)，屬于一級品；蛋白質的降解使得產品中的游離氮增加，因此大鯢冷凍調理制品的TVB-N含量升高到(15.87±0.45) mg/100g(≤30 mg/100g)。綜上，原料大鯢經腌制后，各項營養指標提升，含水量、Aw和pH值有所降低。

2.4 游離氨基酸含量及分析

游離氨基酸不僅可以增強食品的滋味，也可間接改變食品的風味[13,19]。不同的氨基酸因官能團的不同呈現出鮮味、甜味、硫味和苦味等，不同滋味天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸等鮮味氨基酸，在一定程度上影響著動物蛋白的鮮味[20-21]。

從原料大鯢和大鯢冷凍調理制品中均檢測出的17種游離氨基酸如表6所示，由于蛋白質和多肽的降解，總游離氨基酸由原料大鯢中的1 172.07 mg/100g 增加到1 441.09 mg/100g。其中，大鯢冷凍調理制品中Ala、Pro、Asp、Glu、Gly和Ser 6種呈味氨基酸的含量均高于原料大鯢，呈味氨基酸總量顯著增加，由原料大鯢的438.52 mg/100g增加到624.82 mg/100g，尤其鮮味氨基酸Asp和Glu分別由原料大鯢中的66.35 mg/100g和126.62 mg/100g增加到92.29 mg/100g和212.82 mg/100g，分別增加了39.10%和68.08%。而對滋味有不好貢獻的含硫氨基酸Met和Cys含量則分別下降了32.63%和13.57%。因而通過冷凍調理，大鯢肌肉中游離氨基酸對滋味的貢獻得到明顯提升。

表6 大鯢冷凍調理制品中游離氨基酸組成及含量分析 單位：mg/100g

2.5 呈味核苷酸分析

大鯢冷凍調理制品鮮味不僅與游離呈味氨基酸有關，同時呈味核苷酸也起著重要作用。戊糖與堿基通過糖苷鍵形成核苷，核苷與磷酸通過酯鍵形成核苷酸，當核苷5′-位上的—OH與磷酸基團發生酯化時表現出鮮味活性，其中IMP和AMP是對魚類鮮味貢獻最大的核苷酸，且在增強食品的鮮味方面二者存在協同效應[22-23]。

由表7可知，相比原料大鯢，大鯢冷凍調理制品中ATP、ADP和AMP均無顯著變化，而呈味較強的IMP和GMP含量均有增加，分別由原料大鯢中的(11.10±0.89) mg/kg和(15.50±0.24) mg/kg增加到(55.85±3.26) mg/kg和(18.90±0.11) mg/kg，分別增加了4.03倍和0.22倍；呈味核苷酸總量由(174.41±0.56) mg/kg增加到(223.50±0.74) mg/kg。

表7 大鯢冷凍調理制品中呈味核苷酸組成及含量分析 單位：mg/kg

2.6 大鯢冷凍調理制品滋味強度值的比較分析

TAV是樣本中各呈味物質的含量與其對應的閾值之比，當TAV大于1時，具有滋味活性，對整體滋味輪廓具有顯著貢獻，值越高，貢獻越大[24]。大鯢原料和冷凍調理制品游離氨基酸和呈味核苷酸TAV值見圖5。由圖5可看出，對原料大鯢整體滋味輪廓具有顯著貢獻的為Glu、Arg、Val、His和Met這5種游離氨基酸，而大鯢冷凍調理制品中有Glu、Ala、Arg、Val、His和Met 6種游離氨基酸TAV值大于1，且Glu的TAV值均為最大，其他游離氨基酸對整體滋味起修飾作用。大鯢冷凍調理制品中6種呈味氨基酸的TAV值均增大，呈味核苷酸中IMP的TAV值顯著增大(P<0.05)，表明大鯢冷凍調理制品的滋味得到改善與提升。

2.7 EUC分析

YAMAGUCHI等[25]對呈味核苷酸及游離氨基酸之間的相互作用進行感官實驗，提出味精當量評價模型，即使用EUC表示鮮味游離氨基酸與鮮味核苷酸兩者之間的協同效應。由表8可看出，原料大鯢和大鯢冷凍調理制品肌肉的EUC分別為1.01 g MSG/100g和3.08 g MSG/100g，所具有的鮮味強度分別相當100g肌肉中有1.01 g和3.08 g味精產生鮮味，而味精閾值為0.03 g/100mL，此時大鯢原料和大鯢冷凍調理制品均呈現強烈的鮮味。大鯢原料經冷凍調理后EUC提高了2.05倍，表明大鯢經腌制加工可使制品的鮮味明顯提升。

圖5 游離氨基酸和呈味核苷酸 TAV 值Fig.5 TAV values of free amino acids and flavored nucleotides

表8 大鯢冷凍調理制品ai、bi、aj、bj和EUC值Table 8 The values of ai, bi, aj, bj and EUC of frozen preparations of giant salamander

3 結論

本研究采用響應面法優化冷凍調理工藝，旨在開發糟味大鯢冷凍調理制品，所得最佳條件為：加鹽量2.90%、腌制溫度6.25 ℃、腌制時間73.40 h，此條件下生產的大鯢冷凍調理制品色澤紅潤，魚肉緊密有彈性，具有獨特糟香味。經冷凍調理工藝后大鯢營養得到改善，蛋白質含量[(18.55±0.17)%]和脂肪含量[(2.07±0.17)%]均高于原料大鯢，且調理后其屬于低鹽制品[鹽分含量(3.17±0.10)%]，符合健康飲食理念。

冷凍調理后大鯢制品的鮮味和滋味都得到明顯提升。總游離氨基酸由1 172.07 mg/100g增加到1 441.09 mg/100g。其中，Ala、Pro、Asp、Glu、Gly和Ser 6種呈味氨基酸總量顯著增加(由438.52 mg/100g增加到624.82 mg/100g)，尤其鮮味氨基酸Asp和Glu分別增加了39.10%和68.08%。呈味核苷酸總量由(174.41±0.56) mg/kg增加到(223.50±0.74) mg/kg，Glu、Ala、Arg、Val、His和Met這6種游離氨基酸TAV值大于1，對制品整體滋味輪廓具有顯著貢獻；EUC則由1.01 g MSG/100g提升到3.08 g MSG/100g，增加了2.05倍。該研究為開發大鯢冷凍調理制品和提高大鯢的利用價值提供了科學的理論基礎。