亞油酸氧化引起大足黑山羊肌原纖維蛋白保水性變化的機制研究

鐘玉潔，武煊，江依，田冰，楊吉霞，陳應娟，陶曉奇，3*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市動物疫病預防控制中心，重慶，401120) 3(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室，重慶，400715)

肌肉保水性的變化會導致肉的風味、多汁性等隨之改變，提高加工成本，導致經濟損失[1]。目前，許多研究表明蛋白氧化對肉保水性有著不可忽視的作用。BERTRAM等[2]發現肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)在氧化后，MP保水性下降，形成大量二聚酪氨酸，提出氧化交聯產物會對MP保水性產生消極影響。BAO等[3]研究認為氧化對于肉蛋白的保水能力是促進因子(氧化導致凈負電荷增多)和抑制因子(氧化導致交聯聚集)之間的平衡。ZHANG等[4]的研究也表明適度氧化有助于蛋白質凝膠保持較高的保水性，而過高的氧化會導致保水性降低。

通常，肌肉中的氧化以脂質氧化為主。脂質氧化過程中易生成α、β-不飽和醛等次級脂質氧化產物，例如丙二醛、丙烯醛等。不飽和脂肪酸易于氧化，生成多種活性氧(reactive oxygen species，ROS)物質，形成氧化脅迫環境[5]。ROS會攻擊肌肉蛋白質并導致氧化修飾，從而影響其電荷變化以及肉品的保水性[6]。ZHANG等[7]研究表明,脂質氧化產生的ROS可以攻擊蛋白質的敏感氨基酸側鏈，從而誘發MP氧化。此外，蛋白質氧化產生的自由基物質也可以轉移到脂質部分，從而促進脂質氧化[8]。目前，亞油酸已被廣泛用于構建模擬脂質氧化系統。JIANG等[9]構建亞油酸氧化體系誘導MP去折疊和交聯，發現MP凝膠保水性降低。楊玉玲等[10]通過亞油酸體系研究MP氧化對凝膠質構的影響，結果表明，適度氧化有助于改善凝膠特性。

我國肉用山羊中，重慶大足黑山羊因其處于特殊的自然環境與近百年的封閉養殖，具有營養豐富、肉質鮮美等特點，成為國內市場食用的優勢品種，極具經濟價值[11-12]。與其他肉類相比，大足黑山羊肉的多不飽和脂肪酸含量較高[13]，其中，亞油酸含量約占總脂肪酸的10.48%[12]。黑山羊肌肉組織中，MP是最主要的功能性蛋白，在肉品中起著非常重要的作用。在羊肉推廣運輸和加工過程中，不可避免地會發生脂質氧化和蛋白質氧化等嚴重問題，使羊肉保水性及其制品品質下降，造成經濟損失。

保水性是肉制品的重要品質屬性，MP的氧化修飾會使得保水性發生改變[4]。凈電荷的增加會引起MP膨脹并改善保水性，而結構限制則禁止無限膨脹[14]。然而，MP氧化如何調節促進因子和抑制因子之間的平衡來影響保水性，以及哪一個因子對這種平衡起主導作用還很少被探討。因此，本研究基于亞油酸氧化體系探究黑山羊肉MP的氧化修飾及對電荷與保水性的影響，以期從電荷水平深入理解MP氧化并為有效調控黑山羊肉蛋白氧化帶來的品質劣變提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取重慶大足縣同一牧場(24±6)月齡的黑山羊，宰后取其背最長肌，在0～4 ℃下分割成每塊200 g，置于液氮中快速運輸至實驗室，保存在-80 ℃冰箱中待使用。

酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、三氯乙酸、乙酸乙酯、甘氨酸、溴酚藍、2,4-二硝基苯肼、5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)、十二烷基硫酸鈉、亞油酸(分析純)，范德(北京)生物科技有限公司；SDS-PAGE試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；脂肪氧合酶(分析純)，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

YP-B10002電子分析天平，上海光正醫療儀器有限公司；2K-15冷凍離心機，德國Sigma公司；F-2500熒光分光光度計、UV-16001紫外-可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；XHF-D內切式勻漿機、SCIENTZ-12 N真空冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 MP提取

參考JIANG等[9]的方法提取MP。將黑山羊里脊肉的結締組織和筋膜剔除，切碎后加入4倍體積的磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，11 500 r/min均質化2 min后冷凍離心(4 ℃、3 500×g、10 min)，整個過程重復3次。隨后加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.25、0.1 mol/L NaCl)，相同條件下均質離心。接著加入磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、0.1 mol/L NaCl)，均質后用4層紗布過濾，濾液離心10 min，所得沉淀即為MP提取物，貯存在4 ℃條件下并在12 h內使用。采用雙縮脲法測定蛋白質濃度。

1.3.2 亞油酸氧化處理

參考JIANG等[9]的方法建立氧化體系。將MP重懸在磷酸鹽緩沖液(pH 6.0、0.6 mol/L NaCl)中，調節MP質量濃度為10 mg/mL。在MP重懸液中加入3 750 unit/mL脂肪氧合酶和不同質量的亞油酸，其終濃度為0(對照組)、2、5、10、15、20 mmol/L。將樣品置于4 ℃、黑暗、密封環境中孵育24 h后，加入丁基羥基甲苯終止反應，3 500×g、4 ℃離心10 min，所得沉淀用磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)洗滌2次，除去多余的丁基羥基甲苯和亞油酸。

1.3.3 保水性測定

參考PENG等[15]的方法并稍作修改。將MP置于離心管中，80 ℃干燥12 h。保水性計算如公式(1)所示：

(1)

式中：W0，離心管質量，g；W1，干燥前離心管與MP沉淀質量，g；W2，干燥后離心管與MP沉淀質量，g。

1.3.4 Zeta電位測定

參考CAI等[16]的方法并稍作修改。將MP溶液(1 mg/mL)注入Zeta電位皿中，散射角調節為90°，平衡時間60 s，在25 ℃下進行測試。

1.3.5 氨基酸分析

參考ZHANG等[4]的方法并稍作修改。稱取20 mg凍干MP于帶蓋消化玻璃管中，加入5 mL 6 mol/L HCl混勻，110 ℃水解24 h。冷卻后，用氮氣將水解產物吹干。隨后用0.02 mol/L HCl定容至50 mL。取少量溶液離心后，用0.22 μm濾膜過濾。用自動氨基酸分析儀測試過濾后的溶液。

1.3.6 羰基含量測定

(2)

1.3.7 總巰基含量測定

根據WANG等[18]的方法評估總巰基含量。取1 mL 5 mg/mL MP溶液用9 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L、pH 7.0、0.6 mol/L NaCl、10 mmol/L EDTA-2 Na和8 mol/L 尿素)稀釋。取3 mL稀釋液與400 μL 1 mmol/L 2-硝基苯甲酸溶液混合，40 ℃孵育30 min后，測量溶液在412 nm處的吸光度。通過摩爾消光系數[13 600 mol/(L·cm)]計算總巰基的含量。

1.3.8 表面疏水性測定

參考CHELH等[19]的方法并稍作修改。用蒸餾水配制1 mg/mL的溴酚藍溶液。將MP溶液稀釋至5 mg/mL。分別取1 mL的稀釋液、1 mL 磷酸鹽緩沖液(對照組)與200 μL的溴酚藍混勻，充分振蕩，25 ℃ 的條件下反應 10 min，離心(2 000×g，15 min， 4 ℃)。取0.4 mL上清液，加入3.6 mL磷酸鹽緩沖液(40 mmol/L，pH 6.8)稀釋，在 595 nm處測定吸光度。表面疏水性以溴酚藍的結合量表示，計算如公式(3)所示：

(3)

1.3.9 傅里葉紅外光譜分析

本研究以酪蛋白酸鈉為乳化劑，通過pH循環法制備丁香酚微乳，再通過海藻酸鈉對丁香酚微乳進行修飾。考察兩種微乳的粒徑分布、包封率、pH、離子、儲藏穩定性及釋放特性。結果表明，海藻酸鈉修飾能提高丁香酚微乳平均粒徑，具有相當丁香酚的包封率；海藻酸鈉修飾能夠顯著提高丁香酚微乳的pH穩定性，且具有良好的離子和儲藏穩定性；在環境pH為7.0條件下，海藻酸鈉修飾微乳的釋放速率稍高于丁香酚微乳。

參考ZHOU等[20]的方法并稍作修改。準確稱取1 mg MP凍干粉末，與100 mg KBr標準品混合研磨，壓片后在400～4 000 cm-1進行全波段掃描，掃描次數累加64次。

1.3.10 色氨酸內源熒光分析

參考CAO等[21]的方法并稍作修改。將MP質量濃度調節至1 mg/mL。用熒光分光光度計在300～400 nm的光譜范圍內進行掃描，激發波長為295 nm，掃描速度為1 500 nm/min，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.3.11 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS-PAGE)分析

參考JIANG等[9]的方法并稍作修改。將MP質量濃度調節至2 mg/mL。加入3倍體積的buffer溶液(未還原狀態不添加β-巰基乙醇)制備電泳樣品，使用時取上清液進行電泳操作。電泳完成后，將凝膠染色30 min，隨后用脫色液脫色40 min。分子質量由蛋白質標記物測定(10～180 kDa)。

1.3.12 數據處理

本研究中每個處理均進行3次平行試驗。用SPSS統計軟件(19.0 版本，美國 SPSS 公司)進行數據處理，采用單因素方差分析法進行顯著性差異檢驗(P<0.05表示差異顯著)。通過PeakFit 4.12分析紅外光譜，用Origin 8.5進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 保水性及電荷分析

2.1.1 保水性

保水性主要取決于MP的結構性質與分子間相互作用力。由圖1可知，MP保水性隨著氧化強度的增加而顯著上升(P< 0.05)。當亞油酸濃度為5 mmol/L時，MP保水性約為對照組(0 mmol/L)的2倍。這可能是由于低強度氧化時，凈負電荷增加(圖2) 導致保水性增加。隨著氧化強度的進一步提高，MP保水性顯著下降(P< 0.05)，且均低于對照組。這與BAO等[3]對豬肉MP保水性的研究結果一致。LIU[22]的研究指出,高度氧化修飾引起的蛋白質交聯和聚集可能是降低保水性的一個重要因素。

圖1 不同濃度亞油酸氧化體系對MP 保水性的影響Fig.1 The effect of different concentrations of linoleic acid oxidation system on MP water-holding 注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.1.2 Zeta電位

Zeta電位值可以監測蛋白質物理和化學狀態的細微變化，是直觀表現蛋白凈負電荷變化情況的重要指標[23]。由圖2可知，電位絕對值整體呈現出先上升后下降的趨勢，亞油酸濃度較低時(<10 mmol/L)，MP的凈負電荷增加(P<0.05)，說明低強度的氧化使MP溶液體系變得穩定，這與張海璐等[24]的研究結果相同。BAO等[3]的研究指出,輕度氧化修飾使蛋白質凈負電荷增加，改善交聯和靜電相互作用，從而提高保水性。亞油酸濃度較高時(>10 mmol/L)，電位絕對值顯著降低(P<0.05)，這可能是因為氧化強度過高，使得MP劇烈氧化而發生蛋白間的聚集和包埋，導致凈負電荷下降[16]。

圖2 不同濃度亞油酸氧化體系對MP Zeta電位值的影響Fig.2 The effect of different concentrations of linoleic acid oxidation system on MP Zeta potential

2.1.3 氨基酸分析

氧化處理后MP總氨基酸含量明顯少于對照樣品(表1)。含硫氨基酸(半胱氨酸和蛋氨酸)和脯氨酸對ROS非常敏感[25]，因此，這3種氨基酸含量大幅度下降。同時，脂質過氧化分解產物與賴氨酸共價結合[26]，導致賴氨酸含量顯著降低。與對照組相比，高亞油酸濃度(20 mmol/L)氧化導致組氨酸減少了17%(P<0.05)。通常，組氨酸殘基以質子化形式存在，帶有正電荷，且其氧化是羰基形成的原因[27](圖3)。組氨酸含量降低使MP失去正電荷，導致肌球蛋白和肌動蛋白絲的凈負電荷增加。此外，肽鏈斷裂后的碎片可能會對MP產生額外的電荷[28]。一般認為，凈負電荷增加可以提高肉的保水性[6]。

表1 不同濃度的亞油酸氧化體系對MP氨基酸含量的影響 單位：mg/g

2.2 蛋白質氧化分析

2.2.1 羰基和巰基

蛋白質羰基化可以由多種途徑引發并且涉及某些氨基酸殘基的損失。通常，這些氨基酸以正電荷形式存在，損失后會增加蛋白質的凈負電荷，從而預估蛋白質凈電荷改變[29-30]。由圖3可知，隨著亞油酸濃度的增大，羰基含量由0.44 nmol/mg增加到2.09 nmol/mg，呈現連續上升趨勢(P< 0.05)，這一結果與JIANG等[9]報道的牛肉MP中羰基含量一致。UTRERA等[30]研究發現蛋白質羰基化與許多功能性指標(溶解度、保水性、起泡性等)相關，可質子化氨基酸的損失會改變MP電荷分布和整體電子排列，引起MP分子間相互作用發生變化，從而影響蛋白質的保水性。

MP中的半胱氨酸巰基在氧化體系中非常敏感，易提取氫原子生成硫中心自由基，從而導致巰基含量降低[12]。由圖3可知，與未氧化(0 mmol/L)MP相比，氧化后MP巰基含量顯著降低(P<0.05)，該值接近于ZHOU等[31]報道的豬肉氧化過程中MP巰基含量。氧化程度越高，被氧化成二硫鍵的巰基越多，測得的總巰基含量就越少。

圖3 不同濃度亞油酸氧化對MP羰基和巰基含量的影響Fig.3 Effect of different concentration linoleic acid oxidation on the carbonyl and total sulfhydryl content of MP

2.2.2 表面疏水性

蛋白質表面疏水性是影響蛋白基團表面正負電荷數量和排列方式變化并表征蛋白水合效應和變性程度的重要指標[32]。由圖4可知，隨著亞油酸濃度的增加(0～10 mmol/L)，MP表面疏水性逐漸增加(P<0.05)，這一結果反映出疏水基團的暴露有助于增強表面疏水性，從而導致MP構象變化。較高亞油酸濃度(>10 mmol/L)下，MP的表面疏水性降低，這是由于MP之間形成高分子聚集體，部分屏蔽了蛋白解折疊的影響，或破壞了一些非極性氨基酸[7]。這與Zeta電位絕對值的變化趨勢一致。SUN等[32]的研究表明，MP輕微氧化暴露疏水基團，并誘導電離基團數量增加，從而導致凈負電荷增加，改善保水性。

圖4 不同濃度亞油酸氧化對MP表面疏水性的影響Fig.4 Influence of different concentration linoleic acid oxidation on surface hydrophobicity of MP

2.2.3 二級結構分析(傅里葉紅外光譜)

亞油酸濃度的增加沒有導致紅外譜線發生明顯的偏移和變化，趨勢基本保持一致。由圖5分析可知，酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)中呈現的二級結構含量變化非常明顯。與對照相比，隨著氧化劑的增加，α-螺旋和β-折疊含量呈現降低趨勢，這意味著MP結構更加松散[20]；而無規則卷曲結構顯著增加，β-轉角含量呈現先少量增加后降低趨勢。結果表明,氧化使得羊肉MP的螺旋、折疊之間相互轉化，且是有序向無序的轉變。這是因為α-螺旋主要由肽鏈內的氫鍵穩定，β-折疊主要由肽鏈間的氫鍵穩定[33]。隨著氧化程度的增加，MP膨脹，分子內氫鍵減少[34]，導致α-螺旋的破壞和通過肽鏈間氫鍵穩定的β-折疊的形成，繼而使β-轉角和無規則卷曲結構在蛋白發生解折疊后形成。本試驗結果與SUN等[32]報道的氧化豬肉MP中，α-螺旋變化趨勢一致。

圖5 不同濃度的亞油酸氧化對MP二級結構的影響Fig.5 The effect of different concentrations of linoleic acid oxidation on the secondary structure of MP

2.2.4 內源熒光強度

蛋白質結構的變化可以通過內源熒光強度反映。由圖6可知，當在295 nm激發波長時，MP 的色氨酸最大熒光發射波長(λmax)接近335 nm。隨著亞油酸濃度的增加，熒光強度逐漸下降。這與GAN等[35]的研究結果類似。色氨酸熒光的損失可能是由于色氨酸殘基被破壞或蛋白質的展開將色氨酸暴露在親水性的環境中，因而導致熒光的淬滅[36]。上述結果與酪氨酸含量的變化趨勢一致(表1)。因此，亞油酸氧化會降低色氨酸熒光強度，色氨酸殘基暴露于更親水的環境，從而導致MP構象變化。

圖6 不同濃度的亞油酸氧化對MP熒光強度的影響Fig.6 The effect of different concentrations of linoleic acid oxidation on the fluorescence intensity of MP

2.2.5 SDS-PAGE

SDS-PAGE能夠直觀地反映蛋白亞基間發生的聚集、斷裂或降解等情況。在不含有β-巰基乙醇的情況下(非還原條件，圖7-A)，MP肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain，MHC)和肌動蛋白(actin)條帶濃度隨著亞油酸濃度的增加逐漸變淺，同時濃縮膠頂端條帶變深，這說明氧化促進MHC和actin間的交聯和聚集，使得MP分子質量過大而不能進入濃縮膠。在含有β-巰基乙醇的情況下(還原條件，圖7-B)，大部分消失的MP組分逐漸復原，表明MP聚合物通過二硫鍵促進蛋白質交聯。該結果與總巰基含量變化趨勢相一致。然而，圖7-B仍然可以觀察到濃縮膠頂端有聚合物堆積，這表明非蛋白質二硫鍵也參與了蛋白質交聯。一方面，脂質氧化可通過多種途徑引起蛋白質交聯，如色氨酸-色氨酸交聯和二聚酪氨酸交聯等[37-38]；另一方面，氧化激活了μ-鈣蛋白酶等內源酶，使肌球蛋白重鏈和肌動蛋白降解為分子質量更小的蛋白。ZENG等[39]的研究表明蛋白質降解是引起MP腫脹的重要因素，從而影響MP的保水性。

3 結論

本研究采用不同濃度的亞油酸對黑山羊MP進行氧化，以探究不同程度的氧化修飾對羊肉MP電荷水平、結構變化的影響。研究證明，MP氧化會導致結構和電荷總量的改變，從而改變MP和水分子間的相互作用[40](圖8)。隨著亞油酸濃度升高，氧化加劇，巰基含量顯著降低，進而導致MP二級結構之間發生轉化。其中，α-螺旋結構遭到破壞，無規則卷曲結構形成，MP結構趨向于不穩定。MP表面疏水性先升高后降低，水合效應增強。氧化后帶電氨基酸含量均有一定程度的下降，組氨酸側鏈被羰基化，正電荷減少，羰基含量顯著升高，因此MP中的凈負電荷隨著氧化而增加。低濃度氧化(5 mmol/L)條件下，促進因子占據主導地位，凈負電荷的升高使蛋白與水的相互作用力增強，有助于改善肉蛋白的保水性；而高濃度氧化(10 mmol/L)條件下，抑制因子占據主導地位，蛋白結構劇烈變化導致的蛋白質交聯和聚集使得MP的保水性降低。由此可見，亞油酸對黑山羊MP的氧化修飾會導致蛋白表面電荷及深層結構的變化，進而影響MP的保水性。