基于p38MAPK信號通路探討中醫藥防治腦缺血再灌注損傷

張奎明， 葛鸞蝶， 張林悅， 侯露陽， 馬瑞紅， 崔應麟

（1.河南中醫藥大學，河南鄭州 450002；2.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海 200032；3.河南省中醫院，河南鄭州 450002）

缺血性腦卒中是指因腦供血動脈嚴重狹窄或急性閉塞，導致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，該病具有高患病率、高致殘率、高致死率的特點[1]。血管再通療法雖能恢復血供、消除有毒代謝物，但亦會加重神經功能缺損，這種病理過程被稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemiareperfusion injury，CIRI）。其損傷機制與炎癥、氧化應激、線粒體損傷、細胞內鈣超載、谷氨酸興奮毒性、細胞凋亡有關[2]，這些病理改變可加劇神經炎癥，促進小膠質細胞激活，釋放多種促炎介質如細胞黏附因子及趨化因子，參與血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）通透性的改變，導致水腫、細胞凋亡或細胞壞死。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是一類分化保守的絲氨酸、蘇氨酸絲裂原活化蛋白激酶。由MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK 激酶（MAPKK）、MAPK 等三級酶聯機制相關的細胞外信號和細胞內生化反應，可參與細胞的多種病理生理機制[3]。p38MAPK作為MAPK家族成員，可調控細胞核內基因表達，在細胞炎癥、氧化應激、凋亡等生物學過程中發揮重要作用。p38MAPKα 和p38MAPKβ 在神經退行性病變動物模型中可被激活，其中p38MAPKβ 主要存在于星形膠質細胞，p38MAPKα 主要在小膠質細胞表達[4]。p38MAPK 通路與CIRI 病理改變密切相關，以下就其關系進行探討，以期為中醫藥防治CIRI提供理論依據。

1 p38MAPK對CIRI的作用機制

1.1 促進炎癥反應腦缺血后，腦組織所需的氧和葡萄糖減少，三磷酸腺苷（ATP）合成不足，離子失衡，細胞膜去極化，Ca2+通道激活，興奮性谷氨酸的釋放加速Ca2+內流，導致氨基酸毒性及鈣超載，誘發炎癥及細胞凋亡，形成以細胞壞死為核心的梗死區及細胞損傷為主的缺血半暗帶[5]。腦缺血初期，局部梗死區域釋放大量損傷蛋白，激活炎癥反應，導致小膠質細胞及星形膠質細胞活化，趨化因子及炎性細胞介質釋放。此外，腦組織損傷促進炎性因子如白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）及白細胞介素6（IL-6）等的表達。以上炎性因子在缺血后釋放，改變血腦屏障通透性，外周免疫細胞因血腦屏障的通透性增加而富集于病灶，病灶組織的免疫表型暴露，與淋巴細胞發生免疫反應，形成免疫損傷，最終導致腦組織壞死[6-7]。

p38MAPK 作為應激誘導激酶，可調控炎癥因子的表達與釋放。研究[8]表明，CIRI模型組大鼠腦組織磷酸化p38MAPK 顯著增多，而山楂葉總黃酮可拮抗p38活化，抑制下游炎癥反應，減少炎癥因子的釋放，從而減輕腦組織損傷。在CIRI 模型中，p38α 下游靶點MAPK 激活蛋白激酶2（MAPKactivated protein kinase 2，MK2）基因剔除小鼠腦組織中IL-1β、TNF-α的含量明顯低于對照組，而MK2 是p38MAPK 調控炎性細胞因子表達的關鍵下游激酶[9]。亦有研究[10]證實，CIRI 損傷可增加p38MAPK 磷酸化水平，促進其內源性抑制劑的降解，且與腦中IL-1β、TNF-α 和IL-6 水平的下調相一致。Srivastava A 等[11]研究脂多糖誘導的炎癥小鼠模型，結果顯示，相較于對照組小鼠，絲裂原活化蛋白激酶MKK3 基因缺陷組小鼠磷酸化p38MAPK 及促炎因子表達水平明顯降低、抗炎細胞因子IL-10 顯著升高，說明MKK3 是p38MAPK活化的重要上游激酶。p38MAPK 已被確定為神經炎癥信號通路中的特異性標記，在CIRI 炎癥免疫應答中發揮重要作用[12]。

1.2 抑制氧化應激生理條件下，低水平活性氧簇（ROS）在細胞生命活動中充當信號分子；病理狀態下，內源性抗氧化機制無法清除過量ROS，高水平ROS 通過氧化核酸、蛋白質、脂質及細胞器，改變其結構而損傷細胞[13]。

神經元具有高耗氧性。缺氧可導致細胞功能障礙、氧自由基過度生成，而大腦富含磷脂，與ROS 發生化學反應可產生過氧化氫自由基，使膜脂質過氧化而損傷細胞[14]。陳松[15]研究電針預處理心肌缺血再灌注大鼠模型發現，與模型組比較，電針預處理組大鼠心肌組織中ROS、丙二醛、超氧化物歧化酶、p38、絲裂原活化蛋白激酶MKK3及MKK6 表達顯著降低，而經p38MAPK 通路阻滯劑SB203580 預處理大鼠的丙二醛、超氧化物歧化酶及p38MAPK 表達無明顯差異，MKK3 及MKK6表達則降低，提示p38MAPK 信號通路參與氧化應激過程。實驗研究表明，黃酮類化合物通過抑制磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）的表達而激活Nrf2通路，促進酶類抗氧化劑的表達[16]。青蒿琥酯對腦缺血再灌注損傷的保護作用可能與調節ROS 的生成有關[17]。

1.3 調控細胞凋亡神經元具有高代謝活性和能量儲存有限的特點，對缺血性損傷尤為敏感，因此神經元凋亡是CIRI 的主要病理結果。磷酸化p38MAPK 促進炎性細胞因子釋放而觸發缺血神經元凋亡級聯反應，加重腦組織神經損傷[18]。促凋亡基因Bax 和抗凋亡基因Bcl-2 是調控神經細胞生命進程的關鍵因素。Bax促進細胞色素C或促凋亡相關因子的釋放，觸發胱天蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， caspase）凋 亡 級 聯 反 應，caspase-9及caspase-3被激活，可導致細胞凋亡[19]。

p38MAPK 通過激活環磷酸腺苷反應元件結合蛋白，上調Bcl-2 基因表達，而Bcl-2 與Bax 表達比值決定缺血神經元的生命進程，比值上升可阻止Bax活化及移位，從而維持線粒體功能，抑制細胞凋亡，而其比值降低則促使線粒體Bax 同源寡聚，誘發線粒體外膜通道的損傷，繼而激活細胞色素C 介導的凋亡級聯反應[20]。實驗研究[21]表明，阿魏酸通過p38MAPK 通路限制Bax 轉位，從而保持線粒體的完整性，發揮腦保護作用。亦有學者研究p38MAPK 信號在游離膽紅素孵育的神經元中的激活，結果發現游離膽紅素孵育可促進MKK3/MKK6 及p38MAPK 的磷酸化，隨后啟動核因子κB（NF-κB）的激活、轉位，導致神經元凋亡[22]。caspase-3 作為多種凋亡途徑的共同下游產物，是細胞凋亡的關鍵蛋白酶，p38MAPK 作用于caspase-3的上游，活化的caspase-3可裂解基因修復酶、抑制受損基因的修復，加速缺血神經細胞的凋亡[23]。

p38MAPK 在腦缺血再灌注損傷機制中的作用見圖1。

圖1 p38MAPK在腦缺血再灌注損傷機制中的作用Figure 1 Role of p38MAPK in the mechanism of cerebral ischemia-reperfusion injury

2 基于p38MAPK信號通路探討中醫藥防治CIRI的機制

CIRI 可歸屬于中醫學的缺血性中風范疇。其形成機制是在肝腎虧虛、氣血不足的基礎上，風、火、痰、瘀、虛互相搏結，上逆犯腦，導致腦脈痹阻、氣機不通，因而發病。缺血性中風具有起病急驟、變化迅速、中老年多發的特點。《靈樞·刺節真邪》云：“虛邪偏客于身半，其入深，內居榮衛，榮衛稍衰，則真氣去，邪氣獨留，發為偏枯。”指出體虛為中風之始，在此基礎上，歷代醫家加以闡發。金元時期的李杲首次提出氣虛為內風之本；清代的王清任集粹百家，博采眾長，于《醫林改錯·半身不遂本源》進一步闡明氣虛中風的基礎，并在《醫林改錯·論抽風不是風》中創新性地提出“因虛致瘀，氣虛血瘀”理論。津血同源，血瘀津凝，津凝痰生，痰濁血瘀可相互轉化、互為因果，終導致“痰瘀同病”。清代葉桂在《臨證指南醫案·中風》中闡明氣虛津停，津停則痰濕內生的機制，認為氣虛中風者多兼見痰濁、水濕。由此可見，痰、瘀、虛是缺血性中風的主要證候因素。動脈粥樣硬化是缺血性中風的常見原因，臨床研究表明大多數CIRI 患者具有動脈粥樣硬化病史，磁共振成像顯示腦血管斑塊性狹窄[24]，這與中醫氣虛血脈失充，痰瘀阻滯而氣失升降的機制相合。因此，缺血性中風的主要病機為氣虛血瘀、痰瘀互阻，治療當以益氣活血、通脈祛濁為主。

2.1 益氣活血法氣虛血瘀為缺血性中風發病的基礎。研究表明，益氣活血法能有效擴張腦血管，改善腦組織缺血缺氧狀態及舌象、脈象、血象指標，促進血管新生蛋白表達[25]。益氣通脈方是崔應麟教授根據多年臨證經驗研制的院內制劑，該方藥簡力專，療效顯著，以人參、丹參、三七、水蛭、土鱉蟲、大黃組成，人參培補元氣，氣旺脈通，血行瘀化，扶正祛邪，是為君藥；丹參活血通經、祛瘀止痛，配伍三七化瘀止血、補虛生新，使瘀去新生、循經有序，是為臣藥；水蛭活血通經，配合土鱉蟲破血逐瘀，引藥入經，循行周身，行中有和，破而不峻，是為佐藥；大黃苦寒，瀉下降濁，涼血逐瘀，攻守兼備，既可清瀉君藥之熱，亦可通血氣、和五臟，推陳致新，是為佐使之藥。諸藥合用，標本兼治，共奏益氣活血、化瘀通絡之功。

藥理學研究證實，益氣通脈方中的部分組成藥物可通過p38MAPK 信號通路抑制炎癥反應、改善氧化應激、控制細胞凋亡，減輕缺血半暗帶損傷[26-27]。人參天然活性成分Rg1 具有神經營養作用，其對CIRI的保護機制，是基于p38MAPK抗氧化應激相關的凋亡效應、抑制炎癥免疫刺激的壞死效應和調控神經細胞周期3個方面[28]。丹參可減輕氧化性損傷，改善能量代謝，從而抑制中性粒細胞浸潤，減少缺血腦組織p38MAPK 的磷酸化，調控其下游原癌基因的表達，改變凋亡基因caspase-3 介導的凋亡，也能抑制一氧化氮合酶，下調基質金屬蛋白酶表達，保護受損血腦屏障[29-30]。三七能抑制p38MAPK上游靶點MAPK14蛋白活化，從而抑制p38MAPK磷酸化，減少ROS含量，增加缺氧復氧細胞內的超氧化物歧化酶表達，降低細胞內丙二醛含量及乳酸脫氫酶漏出，緩解細胞氧化及炎癥損傷[31-32]。水蛭提取物通過p38MAPK信號通路調節Bcl-2及Bax蛋白含量，降低腦細胞凋亡率；還能提高血清或腦組織中超氧化物歧化酶活性，降低丙二醛及一氧化氮含量，減少細胞間黏附分子1、血管細胞黏附分子1 及血小板衍生生長因子等細胞因子的產生，從而減輕CIRI的腦損傷[33-34]。土鱉蟲提取液能明顯延長腦缺血缺氧小鼠存活時間，增強缺血缺氧小鼠腦組織超氧化物歧化酶活性，提高丙二醛含量，降低一氧化氮合酶活性，減少一氧化氮生成，其腦保護機制與其通過p38MAPK 通路發揮抗氧化作用有關[35]。大黃治療CIRI 的有效成分為大黃酚，能清除CIRI 產生的大量ROS，有效降低一氧化氮介導的細胞毒性，抑制p38MAPK 的炎癥級聯反應，減少血栓形成及血小板聚集和黏附，并通過p38MAPK 通路降低Bax 及caspase-3 表達，減輕神經細胞損傷[36-37]。

2.2 溫陽通脈法缺血性中風患者頸動脈粥樣硬化斑塊患病率約為76.9%，可見動脈粥樣硬化斑塊是缺血性中風的主要危險因素。穩定或消除動脈粥樣硬化斑塊對防治CIRI 具有重要意義[38]。頸動脈粥樣硬化斑塊在中醫理論中無固定病名，有學者依據其部位命名為“人迎脈積”[39]。中醫認為，“人迎脈積”的病機為氣虛血瘀。氣虛則血滯，滯積則為瘀，瘀血壅滯則血脈不通、氣機不利；血瘀則津停，津液失布則結聚成痰，痰為瘀之漸，瘀為痰之果，相互膠著則為痰瘀，痰瘀互阻，膠著沉附而成斑塊[40]。臨床表現如頭痛、頭暈、肢體麻木、思維遲鈍等可反映動脈硬化負荷程度，預測腦血管梗死狀況。崔應麟教授通過大量臨床實踐，發現痰瘀互阻型頸動脈粥樣硬化斑塊最為常見，并依據《黃帝內經》“陽化氣，陰成型”理論及陰陽升降學說，將頸動脈粥樣硬化斑塊的發病機制總結為“陽微氣弱，痰濕不化；濁陰阻脈，通降失常。”其以“溫下通消法”論治，通陽祛濁以復氣機升降，化痰散瘀以復血脈通利，創立通脈祛濁散（主要由桂枝、生大黃、生水蛭、生山楂組成）治療頸動脈粥樣硬化性腦缺血，療效顯著[41]。方中桂枝溫陽化氣、平沖降逆，大黃逐瘀通經、瀉下降濁，二藥升降互用，攻下而不傷正，共祛濁陰，通達陰陽升降之路；水蛭力專走竄、破血通經，山楂行氣散瘀、化濁降脂，二藥通消兼施，清化瘀血痰濁。諸藥相配，通陽祛濁，消痰散瘀。現代藥理研究表明，桂枝具有擴張血管、增加循環血容量、抗凝血、抗血小板聚集的作用，并通過p38MAPK 通路抑制成纖維細胞合成IL-6，降低血管平滑肌細胞增殖能力，從而減少斑塊炎癥損傷[42-43]。大黃能降低甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白水平，增加乳酸脫氫酶的活性進而減少脂質積累，改善體內生化指標，降低血液黏稠度，改善微循環[44-45]。水蛭中的水蛭素作用于凝血過程的不同靶點，可抑制血小板聚集、組織纖溶途徑，發揮抗血栓作用，并能降低p38MAPK 磷酸化水平，抑制巨噬細胞向血管內膜下層遷移，控制脂質條紋、纖維斑塊的形成，防治動脈粥樣硬化[46-47]。山楂可抑制甘油-3-磷酸酰基轉移酶及磷脂酸磷酸水解酶活性，降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平，促進膽固醇代謝，其作用機制與p38MAPK 抗氧化活性及抑制炎性因子釋放有關[48-49]。

3 討論與展望

p38MAPK 通過多種途徑參與腦缺血再灌注損傷（CIRI）的病理改變，其水平在CIRI 腦組織中明顯升高，對腦組織造成二次損傷且證實其抑制劑在腦缺血急性期可保護腦組織免受傷害。但p38MAPK 在CIRI 的確切作用機制尚待深入研究。國內外基礎研究多集中于p38MAPK 蛋白，對其上下游靶點關注較少，臨床研究尚缺乏大樣本支撐且新藥開發周期長、作用機制模糊。中醫臨床注重整體觀念與理法方藥的統一，中藥復方具有多靶點、多功效、全方位的治療特點，基于p38MAPK 信號通路探討中醫藥干預CIRI，可為臨床防治缺血性腦卒中的實驗研究與臨床治療提供思路。