蟬芩顆粒含藥血清對(duì)脂多糖誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞神經(jīng)源性炎癥的干預(yù)機(jī)制

陳侃俊， 趙源， 石煒弘， 竇丹波， 呂俊， 余小萍， 沈若冰

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 201203；3.上海市浦東新區(qū)老年醫(yī)院，上海 201314）

感染后咳嗽（post infectious cough）是亞急性咳嗽主要病因之一[1]，占亞急性咳嗽病因的48.4%，發(fā)病率高，上呼吸道感染的患者11%～25%會(huì)發(fā)生感染后咳嗽[2]。感染后咳嗽的發(fā)生機(jī)制尚未明確，隨著廣泛分布于呼吸道的速激肽網(wǎng)的發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)源性炎癥在感染后咳嗽機(jī)制中的作用也逐漸成為研究熱點(diǎn)之一[3]。研究顯示，激活的誘導(dǎo)型一氧化氮 合 酶（iNOS）/一 氧 化 氮（NO）-環(huán) 磷 酸 鳥 苷（cGMP）-cGMP 依賴性蛋白激酶（PKG）信號(hào)通路及瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（TRPV1），可導(dǎo)致P 物質(zhì)（SP）等速激肽釋放，在神經(jīng)源性炎癥中起重要作用[4-5]。蟬芩顆粒是上海市名中醫(yī)黃吉賡教授的治咳經(jīng)驗(yàn)方。臨床研究表明，蟬芩顆粒治療風(fēng)邪戀肺型感染后咳嗽患者有較好的療效[6]。前期實(shí)驗(yàn)研究[7]表明，蟬芩顆?？蓽p輕感染后咳嗽大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，機(jī)制可能與下調(diào)TRPV1 蛋白表達(dá)、減少速激肽釋放有關(guān)，其上游機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，iNOS 可能是蟬芩顆粒治療感染后咳嗽的潛在靶點(diǎn)[8]。因此，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)，選擇人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 作為研究對(duì)象，以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)構(gòu)建神經(jīng)源性炎癥細(xì)胞模型，觀察蟬芩顆粒對(duì)模型細(xì)胞iNOS/NOcGMP-PKG 信號(hào)通路作用的影響，為該方應(yīng)用于感染后咳嗽提供分子生物學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人支氣管上皮細(xì)胞16HBE，購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號(hào)：CL-0249。

1.2 藥物與試劑蟬芩顆粒（上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科制備，批號(hào)：200401，14 g/包，主要成分：僵蠶、柴胡、黃芩、竹瀝半夏、生甘草等）。LPS、N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）（美國(guó)Sigma 公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8，日本同仁株式會(huì)社）；TRIzol RNA 提取試劑（美國(guó)Thermo Fisher 公司）；逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒、熒光定量SYBR Green試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；iNOS 抗體（英國(guó)Abcam 公司）；可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（sGC）抗體（英國(guó)Abcam公司）；PKG抗體（美國(guó)Proteintech 公司）；β-actin抗體（英國(guó)Abcam公司）；鈣離子熒光探針（日本同仁株式會(huì)社）。

1.3 儀器PCR儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)：7500）；顯微鏡（日本Olympus 公司，型號(hào)：BX51TF）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Rayto 公司，型號(hào)：RT-6000）；Mini Trans-Blot垂直電泳儀系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司，型號(hào)：1703930）； CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司，型號(hào)：XD-101）；Cary Eclipse 分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）。

1.4 蟬芩顆粒含藥血清的制備與保存

1. 4. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 16 只SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量180 ～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。將16 只大鼠隨機(jī)分為空白組與蟬芩顆粒高、中、低劑量組，每組4只。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2020-0009，溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h光照。研究?jī)?nèi)容與過程中涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，均符合國(guó)家對(duì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的有關(guān)要求，倫理批準(zhǔn)編號(hào)：PZSHUTCM211115014。

1.4.2 灌胃與血清采集 按照中藥血清藥理學(xué)方法[9-10]，蟬芩顆粒高、中、低劑量組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后開始灌胃給藥。蟬芩顆粒成人（按60 kg體質(zhì)量計(jì)算）給藥劑量是84 g/d，大鼠給藥劑量按“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比值表”換算，為17.6 g·kg-1·d-1（高劑量）、8.8 g·kg-1·d-1（中劑量）、4.4 g·kg-1·d-1（低劑量）?？瞻捉M灌胃等體積生理鹽水。各組大鼠均按照每次1 mL 灌胃，每日早晚2次，連續(xù)3 d。于末次灌藥后1 h，用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，無菌條件下分離、暴露腹主動(dòng)脈，取血，置于4 ℃冰箱中靜置1 h 后，以3 000 r/min（離心半徑為3 cm）離心20 min，無菌收集血清，同組血清混合。將4 組血清置于56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm 微孔濾膜過濾，密封，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)16HBE 細(xì)胞，以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基（其中含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），置于37 ℃5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞大部分融合并基本長(zhǎng)滿瓶底后，2.5 g/L 胰蛋白酶消化傳代。選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞分組與干預(yù)

1.6.1 細(xì)胞分組 按隨機(jī)數(shù)字表將細(xì)胞分為6組：空白組，模型組，蟬芩顆粒高、中、低劑量組，L-NAME（iNOS抑制劑）組。

1.6.2 細(xì)胞干預(yù) 空白組：加入含10%空白血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。模型組：給予LPS（1 μg/mL，12 h，預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得LPS 最佳損傷濃度及時(shí)間）+含10%空白血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。蟬芩顆粒高、中、低劑量組和L-NAME 抑制劑組在加入模型組相同量的LPS 基礎(chǔ)上，分別對(duì)應(yīng)加入10%高、中、低劑量蟬芩顆粒含藥血清及L-NAME 0.1 mmol/L（LPS干預(yù)前預(yù)處理1 h）[11-12]。各組干預(yù)12 h后收集細(xì)胞備用。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1. 7. 1 CCK-8 法檢測(cè)16HBE 細(xì)胞活力 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16HBE 細(xì)胞，使用胰酶進(jìn)行消化，按8×103個(gè)/mL細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，同步化培養(yǎng)24 h，再給予相應(yīng)藥物干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)12 h。吸棄培養(yǎng)基，更換為10%CCK-8稀釋液，100 μL/孔，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)后應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度（OD）值。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白孔OD值）×100%。

1.7.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)16HBE 細(xì)胞iNOS、sGC、PKG、TRPV1、SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1的mRNA表達(dá) 采用TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA，按試劑盒說明書合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增以檢 測(cè) 各 組 中iNOS、sGC、PKG、TRPV1、SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 的表達(dá)水平。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火55 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán)。引物由金唯智公司合成。引物序列見表1。各組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。用2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列Table 1 The PCR primer sequences

1.7.3 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)16HBE細(xì)胞iNOS、sGC、PKG 的蛋白表達(dá) 取各組細(xì)胞，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min 后，離心收集上清，二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度。加入制備好的電泳液，上樣量為每泳道30 μg，濃縮膠電泳電壓80 V，分離膠電泳電壓120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣時(shí)，停止電泳。將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。加入50 g/L 脫脂奶粉的封閉液，于搖床上室溫封閉1.5 h。用TBST 洗膜3 次，每次10 min，分別加入稀釋好的一抗iNOS抗體（1∶10 000）、SGC 抗體（1∶1 000）、PKG 抗體（1∶2 000）、β-actin 抗體（1∶1 000），4 ℃反應(yīng)過夜。次日先以TBST 洗膜3 次，每次10 min，后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶5 000）或羊抗鼠IgG（1∶10 000），室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)2 h。再用TBST 洗膜3 次，每次10 min。按電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒說明進(jìn)行顯影。應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1. 7. 4 熒光分光光度法檢測(cè)16HBE 細(xì)胞[Ca2+]i水平 細(xì)胞分組并干預(yù)后，使用PBS 溶液漂洗3 次，除去培養(yǎng)基，加入熒光探針Fluo-4 AM 工作液（終濃度5 μmol/L），溶液量以能充分覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。避光37 ℃負(fù)載40 min。隨后用PBS 溶液漂洗3 次，再避光37 ℃繼續(xù)孵育20 min，以保證Fluo-4 AM在細(xì)胞內(nèi)被充分轉(zhuǎn)變?yōu)镕luo-4。使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Fluo-4 熒光強(qiáng)度，以確定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為520 nm。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 次重復(fù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），若方差不齊，采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖表使用Graphpad Prism 5 軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 蟬芩顆粒含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞活力的影響CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示：與空白組比較，LPS 處理后16HBE 細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01）；高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 可恢復(fù)LPS 誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞活力的下降（P＜0.05），中、低劑量蟬芩顆粒無明顯作用（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖1。

圖1 各組16HBE細(xì)胞活力比較Figure 1 Comparison of 16HBE cell viability between various groups

2.2 蟬芩顆粒含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞信號(hào)分子iNOS、sGC、PKG，TRPV1通道，神經(jīng)源性炎癥相關(guān)炎癥因子SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響應(yīng)用RT-qPCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中iNOS、sGC、PKG的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)上調(diào)了16HBE 細(xì)胞中iNOS、sGC、PKG 的mRNA 表達(dá)水平（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞中iNOS、sGC、PKG mRNA表達(dá)的升高（P＜0.01），蟬芩顆粒中劑量有效抑制了LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中iNOS、sGC mRNA的升高（P＜0.05或P＜0.01），蟬芩顆粒低劑量則無顯著性效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖2 ～圖4。

圖2 各組16HBE細(xì)胞中iNOS mRNA表達(dá)水平比較Figure 2 Comparison of the mRNA expression level of iNOS between various groups of 16HBE cells

圖3 各組16HBE細(xì)胞中sGC mRNA表達(dá)水平比較Figure 3 Comparison of the mRNA expression level of sGC between various groups of 16HBE cells

圖4 各組16HBE細(xì)胞中PKG mRNA表達(dá)水平比較Figure 4 Comparison of the mRNA expression level of PKG between various groups of 16HBE cells

RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中TRPV1 mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)上調(diào)了16HBE 中TRPV1 mRNA 的表達(dá)水平（P＜0.01），而高、中劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞中TRPV1 mRNA 的升高（P＜0.05 或P＜0.01），蟬芩顆粒低劑量無顯著性效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖5。

圖5 各組16HBE細(xì)胞中TRPV1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 5 Comparison of the mRNA expression level of TRPV1 between various groups of 16HBE cells

RT-qPCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)上 調(diào) 了16HBE 中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 的表達(dá)水平（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 均有效抑制了LPS 誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞中SP、IL-6、IL-1β、ICAM-1 mRNA 表達(dá)的升高（P＜0.01），中劑量蟬芩顆粒有效抑制了LPS 誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中SP、IL-6、ICAM-1 mRNA表達(dá)的升高（P＜0.05 或P＜0.01），低劑量蟬芩顆粒抑制了SP mRNA 表達(dá)的升高（P＜0.01）。具體結(jié)果見圖6 ～圖9。

圖6 各組16HBE細(xì)胞中SP mRNA表達(dá)水平比較Figure 6 Comparison of the mRNA expression level of SP between various groups of 16HBE cells

圖7 各組16HBE細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)水平比較Figure 7 Comparison of the mRNA expression level of IL-6 between various groups of 16HBE cells

圖8 各組16HBE細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)水平比較Figure 8 Comparison of the mRNA expression level of IL-1β between various groups of 16HBE cells

圖9 各組16HBE細(xì)胞中ICAM-1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 9 Comparison of mRNA expression level of ICAM-1 between various groups of 16HBE cells

2.3 蟬芩顆粒含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞信號(hào)通路iNOS、sGC、PKG蛋白表達(dá)的影響Western Blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，LPS 處理后16HBE 中iNOS、sGC、PKG 蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME有效抑制了LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中iNOS、sGC、PKG 蛋白表達(dá)水平的升高（P＜0.01），中、低劑量蟬芩顆粒的效果不明顯（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖10。

圖10 各組16HBE細(xì)胞中iNOS、sGC、PKG蛋白表達(dá)比較Figure 10 Comparison of he protein expression of iNOS，SGC and PKG between various groups of 16HBE cells

2. 4蟬芩顆粒含藥血清對(duì)LPS誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞[Ca2+]i的影響熒光分光光度法測(cè)細(xì)胞[Ca2+]i，結(jié)果顯示，LPS 處理16HBE 細(xì)胞，導(dǎo)致LPS 誘導(dǎo)16HBE 細(xì)胞中[Ca2+]i 水平顯著上調(diào)（P＜0.01），而高劑量蟬芩顆粒及L-NAME 有效抑制了LPS 誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞中[Ca2+]i水平的升高（P＜0.01），蟬芩顆粒中、低劑量無顯著效果（P＞0.05）。具體結(jié)果見圖11。

圖11 各組16HBE細(xì)胞[Ca2+]i水平比較Figure 11 Comparison of cellular[Ca2+]i level between various groups of 16HBE cells

3 討論

蟬芩顆粒為上海市名中醫(yī)黃吉賡教授的治咳驗(yàn)方，方中：蟬衣、僵蠶、射干疏散風(fēng)熱，化痰解痙利咽，為君；柴胡、黃芩、竹瀝半夏清熱和解樞機(jī)，前胡、白前、杏仁、紫菀、款冬花宣肅并用祛痰鎮(zhèn)咳，為臣；桔梗、枳殼升降肺氣理氣祛痰，丹參、郁金活血理氣，為佐；甘草祛痰止咳調(diào)和諸藥，為使。黃吉賡教授認(rèn)為，感染后咳嗽屬于久咳范疇，其病機(jī)為風(fēng)邪戀肺，治以祛風(fēng)清熱、化痰止咳、理氣活血為主。蟬芩顆粒應(yīng)用于感染后咳嗽患者的治療，療效顯著，可有效改善感染后咳嗽患者的癥狀，提高生活質(zhì)量，減輕氣道神經(jīng)源性炎癥[6]。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，蟬芩顆?？蓽p輕感染后咳嗽大鼠氣道神經(jīng)源性炎癥，其機(jī)制可能與下調(diào)TRPV1表達(dá)、減少速激肽SP的釋放有關(guān)[7]。鑒于蟬芩顆粒治療感染后咳嗽的療效在臨床與實(shí)驗(yàn)研究中均得到驗(yàn)證，本課題組基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，運(yùn)用TCMSP、PharmGKb、TTD、DrugBank 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蟬芩顆粒藥物活性成分及靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)：蟬芩顆粒重要的活性成分有槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷留醇等，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等作用，治療的主要靶點(diǎn)集中在iNOS、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARsγ）等，靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的疾病種類集中在呼吸道疾病及神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[8]。

感染后咳嗽的反射主要受2種不同類別的感覺傳入神經(jīng)纖維控制，分別為有髓鞘Aδ纖維和無髓鞘C 纖維[13]。由感覺神經(jīng)末梢釋放以SP 為主的速激肽所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)稱為神經(jīng)源性炎癥[14]。SP由TAC1基因編碼而成，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞體及神經(jīng)纖維，其mRNA 及蛋白在不同種屬生物的支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等亦有分布[15-18]。SP被激活后可促進(jìn)IL-6、IL-1β、ICAM-1 等炎癥介質(zhì)釋放，激發(fā)炎癥反應(yīng)[19]。支氣管上皮細(xì)胞是感染后咳嗽病理環(huán)節(jié)中參與神經(jīng)源性炎癥的重要效應(yīng)細(xì)胞之一，病毒感染等因素可促進(jìn)胞內(nèi)SP 的表達(dá)，與氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性有關(guān)[17，20]。高表達(dá)的SP 使氣道上皮細(xì)胞受到持續(xù)損害，并可間接刺激咳嗽感受器，導(dǎo)致咳嗽反射敏感性增加，使咳嗽發(fā)作或加重[21]。

NO 作為一種具有極強(qiáng)生物活性的效應(yīng)分子，可由3 種一氧化氮合酶（eNOS、nNOS、iNOS）催化L-精氨酸產(chǎn)生，其中iNOS 在呼吸道疾病的病理狀態(tài)中廣泛表達(dá)，參與炎癥性疾病反應(yīng)過程，與炎癥關(guān)系更為密切，是造成局部組織損傷的因素之一[22]。

TRPV1 是配體門控非選擇性陽(yáng)離子通道，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的感覺神經(jīng)纖維上，尤其是無髓鞘的C 類和部分少髓鞘的Aδ 類纖維[23]，在呼吸道平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞等細(xì)胞上亦有分布[24]。TRPV1能被NO等多種炎癥介質(zhì)激活[21]，sGC是NO的重要受體，它通過β亞基的卟啉基團(tuán)結(jié)合NO 分子，自身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而被激活，活化的sGC催化cGMP，通過結(jié)合PKG 的2 個(gè)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中cGMP結(jié)合位點(diǎn)，激活PKG啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)[25-26]，活化后的PKG 可激活TRPV1[27]，增敏后的TRPV1 通道開放，Ca2+內(nèi)流引起細(xì)胞膜去極化，啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)SP 等速激肽釋放，形成神經(jīng)源性炎癥[28]。在感染后咳嗽等疾病中，TRPV1既可以作為感受器，將刺激信息整合后上傳至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，又可以作為效應(yīng)器，接受中樞信號(hào)，激活后釋放速激肽等炎癥因子引起炎癥反應(yīng)[29]。

本研究采用LPS模擬革蘭氏陰性菌感染的方法誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞神經(jīng)源性炎癥模型[30-32]，結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)后細(xì)胞中IL-6、IL-1β 等炎癥介質(zhì)明顯增高，速激肽SP 也有所升高，提示神經(jīng)源性炎癥細(xì)胞模型復(fù)制成功。在高劑量蟬芩顆粒含藥血清干預(yù)后，炎癥細(xì)胞模型因子IL-6、IL-1β、ICAM-1 及速激肽SP mRNA 水平下降，信號(hào)分子iNOS、sGC、PKG與TRPV1 mRNA（或蛋白）表達(dá)水平也同步下降，且標(biāo)志TRPV1通道活化的Ca2+內(nèi)流減少，與iNOS抑制劑L-NAME作用趨勢(shì)相似。故推測(cè)蟬芩顆粒抑制支氣管上皮細(xì)胞神經(jīng)源性炎癥的作用可能是通過下調(diào)iNOS/NO-cGMP-PKG 信號(hào)通路，抑制TRPV1 通道活化而實(shí)現(xiàn)。本研究為進(jìn)一步深入探索蟬芩顆?？箽獾郎窠?jīng)源性炎癥的靶點(diǎn)，闡明該方治療感染后咳嗽的機(jī)制提供了科學(xué)的依據(jù)和基礎(chǔ)。