基于Wnt/β-catenin信號通路探討益氣活血法對缺血性腦中風急性期大鼠腦神經(jīng)元的保護作用

江利敏， 桑鋒， 劉向哲， 嵇朋， 郭向東

[1.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院體檢中心，河南鄭州 450003；2.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院重點實驗室，河南鄭州450003；3.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病一區(qū)，河南鄭州 450003；4.鄭州市第三人民醫(yī)院（河南大學腫瘤醫(yī)院）神經(jīng)內(nèi)科三病區(qū)，河南鄭州 450003；5.河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院耳鼻喉科，河南鄭州 450003]

缺血性腦中風是具有高致殘率和致死率的臨床常見疾病，是臨床死亡和致殘的主要原因之一[1]。在我國，缺血性腦中風的發(fā)病率占腦卒中總發(fā)病率的60%～80%[2]。缺血性腦中風急性期主要表現(xiàn)為失語、偏癱、口舌歪斜、不省人事等。本病中醫(yī)屬本虛標實之證，病機以氣滯血瘀、腦絡(luò)痹阻為主，益氣活血法為主要治療方法[3]。黃芪和川芎為常用中藥材，黃芪大補元氣、提升中氣，川芎活血行氣、祛風止痛，二者配伍具有補益氣血的功效[4-5]。本課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，以黃芪注射液和川芎嗪（ligustrazine，川芎的有效成分之一）注射液或以含有黃芪和川芎等益氣活血作用的中藥方劑治療缺血性腦中風患者，能夠明顯改善缺血性腦中風患者神經(jīng)功能的缺失。因此，本研究以益氣活血法為治則，采用黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍，建立缺血性腦中風大鼠模型，觀察該配伍對缺血性腦中風急性期腦神經(jīng)元的保護作用及其機制，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1. 1實驗動物40 只6～8 周齡SPF 級SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量為180 ～220 g，購自河南省實驗動物中心[動物合格證號：SCXK（豫）2017-0001]。實驗動物及飼養(yǎng)條件符合《實驗動物管理條件》要求。飼養(yǎng)條件：室溫（22 ± 1）℃，濕度（50 ±10）%，每天定時換氣，保持12 h∶12 h 光暗照明，食水不限。研究方案獲本院倫理委員會批準，實驗嚴格遵循實驗動物使用的3R原則。

1.2 藥物、試劑與儀器黃芪注射液（神威藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，每支裝10 mL，每1 mL 相當于黃芪生藥2 g，批號：國藥準字Z13020999）；川芎嗪注射液（河南福森藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，2 mL∶40 mg，批號：國藥準字H20056061）；尼莫地平注射液（山東新華制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字H10950226）。蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導的dUTP 缺口末端標記法（TUNEL）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技有限公司）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo Scientific 公司）；Wnt3a、β-連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、磷酸化GSK-3β（p-GSK-3β）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單抗，羊抗兔免疫球蛋白（IgG）（美國CST 公司）。雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠，型號：DYCZ-24KS）；PCR 儀（美國Applied Biosystems 公司，型號：7500）；顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：IX53）；多功能凝膠成像系統(tǒng)（美國Syngene公司，型號：G：BOX）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號：Multiskan MK3）。

1.3 分組、造模與給藥所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將40只SPF級SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、益氣活血組，每組各10只。除假手術(shù)組不插栓線外，其余各組大鼠參考文獻方法[6]制備局灶性腦缺血模型。具體方法：麻醉大鼠后將大鼠以仰臥位固定，切開頸部正中部位，分離右頸總動脈與迷走神經(jīng)，結(jié)扎頸外動脈，將頸總動脈和頸內(nèi)動脈夾閉后將栓線插入頸總動脈，然后打開微動脈夾把栓線插入頸內(nèi)動脈，固定好后縫合創(chuàng)口并消毒。造模成功的大鼠在蘇醒后可出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓、站立不穩(wěn)的情況，且提尾時向一側(cè)轉(zhuǎn)圈，如出現(xiàn)上述癥狀即判斷為造模成功[7]。最終模型組、尼莫地平組和益氣活血組各有9、8、9只大鼠造模成功。各組大鼠均在造模成功后10 min 開始給藥治療，給藥劑量結(jié)合文獻方法[8]、人與大鼠體表面積折算公式[8]及預(yù)實驗結(jié)果確定：尼莫地平組大鼠給予腹腔注射0.5 mg/kg 尼莫地平注射液，益氣活血組大鼠給予腹腔注射1.8 mL/kg 黃芪注射液和7.2 mg/kg 川芎嗪注射液，假手術(shù)組和模型組大鼠給予腹腔注射等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)4 d。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 神經(jīng)功能評分 治療前和治療后12、24、48、72、96 h時分別計算各組大鼠Longa 神經(jīng)功能評分，評分標準參考文獻方法[9]。0 分：無神經(jīng)損傷癥狀；1 分：對側(cè)前爪不能完全伸展；2 分：行走時向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：行走時向外側(cè)傾倒；4 分：不能自發(fā)行走，意識喪失；5 分：死亡。剔除評分為0分和4～5分的大鼠。

1. 4. 2 HE 染色法觀察腦神經(jīng)元病理變化 給藥結(jié)束后2 h，將大鼠麻醉固定于手術(shù)臺，開胸，暴露心臟，剪開右心耳，灌注150 mL 生理鹽水沖去血液；然后灌注150 mL 4%多聚甲醛固定，先慢后快，內(nèi)固定完畢后斷頭取腦，置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定48 h。將腦組織常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，切片（厚度為4 μm），脫蠟至水，行HE染色。

1. 4. 3 TUNEL 法觀察腦神經(jīng)元的凋亡情況 取“1.4.2”項中制作的石蠟組織切片，嚴格按照TUNEL 試劑盒說明書步驟操作，置于顯微鏡下拍照記錄。

1.4.4 RT-qPCR法檢測腦組織Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA 表達 給藥結(jié)束后2 h，快速斷頭取腦缺血側(cè)皮層組織，加入TRIzol 裂解液提取總RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本TaKaRa 公司設(shè)計合成，引物序列見表1。采用2-△△CT法計算目的基因mRNA 相對表達水平。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.4.5 ELISA 法檢測腦組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性 給藥結(jié)束后2 h，快速斷頭取腦缺血側(cè)皮層組織，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，應(yīng)用Multiskan MK3型酶標儀檢測。

1.4.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測腦組織Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的表達水平 給藥結(jié)束后2 h，快速斷頭取腦缺血側(cè)皮層組織。研磨勻漿后按照蛋白提取試劑盒說明書提取組織蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，定量完畢后蛋白中加入loading buffer，在EP管中混勻，置于沸水中煮沸5 min使蛋白變性。配制15%的分離膠和5%的濃縮膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），上樣后80 V電泳2 h，60 V轉(zhuǎn)膜2 h，50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，將聚偏氟乙烯（PVDF）膜分別放入Wnt3a、β-catenin、p-GSK-3β、GSK-3β、GAPDH 等一抗稀釋液（1∶1 000）中，4 ℃過夜。第2 天用TBST 緩沖液清洗3 次，每次10 min，然后加入羊抗兔IgG二抗（1∶2 000 稀釋），37 ℃孵育2 h，TBST 緩沖液清洗3 次后滴加電化學發(fā)光液（ECL），反應(yīng)1 min后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影。內(nèi)參蛋白為GAPDH，應(yīng)用ImageJ 軟件分析各個蛋白對應(yīng)的灰度值，計算目的蛋白的相對表達量，蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 統(tǒng)計方法采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），兩樣本比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較表2 結(jié)果顯示：與模型組比較，尼莫地平組大鼠在治療后48、72、 96 h 時的神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05），益氣活血組大鼠在治療后24、48、72、96 h時的神經(jīng)功能缺損評分降低（P＜0.05）。模型組在治療后96 h時的神經(jīng)功能缺損評分低于治療后12 h（P＜0.05），其余時間點的神經(jīng)功能缺損評分無顯著性差異（P＞0.05）。尼莫地平組在治療后48、72、96 h 時的神經(jīng)功能缺損評分低于治療后12 h，并呈時間依賴性降低（P＜0.05）。益氣活血組在24、48、72、96 h時的神經(jīng)功能缺損評分低于治療后12 h，且24、48、72、96 h時的評分呈時間依賴性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較Table 2 Comparison of neurological deficit scores between various groups of rats at different time points （±s，分）

表2 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分比較Table 2 Comparison of neurological deficit scores between various groups of rats at different time points （±s，分）

①P＜0.05，與模型組同一時間點比較；②P＜0.05，與同組12 h 比較；③P＜0.05，與同組24 h 比較；④P＜0.05，與同組48 h比較；⑤P＜0.05，與同組72 h比較

治療后96 h 0.00±0.00 2.26±0.31②1.47±0.20①②③④⑤1.01±0.15①②③④⑤組別假手術(shù)組模型組尼莫地平組益氣活血組鼠數(shù)/只10 989治療前0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00治療后12 h 0.00±0.00 2.67±0.45 2.52±0.38 2.43±0.41治療后24 h 0.00±0.00 2.56±0.42 2.23±0.37 1.72±0.25①②治療后48 h 0.00±0.00 2.49±0.28 2.09±0.29①②③1.35±0.17①②③治療后72 h 0.00±0.00 2.38±0.37 1.79±0.26①②③④1.20±0.13①②③④

2.2 各組大鼠腦神經(jīng)元病理變化比較圖1 結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦神經(jīng)元排列整齊，細胞膜完整，細胞核清晰。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦神經(jīng)元排列紊亂，細胞腫脹破裂，可見明顯的核固縮和核溶解現(xiàn)象。與模型組比較，尼莫地平組和益氣活血組大鼠的腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相對正常，排列紊亂現(xiàn)象減輕，細胞膜基本完整，核固縮和核溶解現(xiàn)象減輕。

圖1 各組大鼠腦神經(jīng)元病理變化比較（HE染色，×400）Figure 1 Comparison of pathological changes of cerebral neurons between various groups of rats（by HE staining，×400）

2.3 各組大鼠腦神經(jīng)元凋亡情況比較圖2、圖3結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦組織幾乎無TUNEL 陽性染色神經(jīng)元，而模型組大鼠腦組織則可見大量TUNEL 陽性染色神經(jīng)元，且神經(jīng)元體積縮小，有核固縮現(xiàn)象，呈黃褐色顆粒狀，神經(jīng)元凋亡率亦顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，尼莫地平組和益氣活血組大鼠腦TUNEL 陽性染色神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠腦神經(jīng)元凋亡率比較（±s）Figure 3 Comparison of cerebral neuronal apoptosis rate between various groups of rats（±s）

2. 4各組大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達比較表3 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Caspase-3、Bax mRNA 表達水平顯著增加（P＜0.05），Bcl-2 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，尼莫地平組、益氣活血組大鼠腦組織Caspase-3、Bax mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05），Bcl-2 mRNA表達水平顯著增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達比較Table 3 Comparison of mRNA expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax in brain tissues between various groups of rats （±s）

表3 各組大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表達比較Table 3 Comparison of mRNA expression of Caspase-3，Bcl-2 and Bax in brain tissues between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

Bax 0.92±0.12 4.98±0.23①2.96±0.18①②2.87±0.17①②組別假手術(shù)組模型組尼莫地平組益氣活血組鼠數(shù)/只10 9 8 9 Caspase-3 1.10±0.13 3.49±0.20①1.58±0.17①②1.82±0.15①②Bcl-2 3.97±0.19 0.95±0.11①2.33±0.14①②2.18±0.16①②

2.5 各組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性比較表4 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、MDA 含量顯著增加（P＜0.05），GSH-Px、SOD 活性顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，尼莫地平組、益氣活血組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、MDA含量顯著減少（P＜0.05），GSH-Px、SOD活性顯著升高（P＜0.05）。

表4 各組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性比較Table 4 Comparison of contents of IL-6，TNF-α，MDA and activities of GSH-Px and SOD in brain tissues between various groups of rats （±s）

表4 各組大鼠腦組織IL-6、TNF-α、MDA含量和GSH-Px、SOD活性比較Table 4 Comparison of contents of IL-6，TNF-α，MDA and activities of GSH-Px and SOD in brain tissues between various groups of rats （±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組尼莫地平組益氣活血組SOD/（U·mg-1）230.51±18.65 101.65±13.88①190.18±16.87①②187.33±17.12①②鼠數(shù)/只10 989 IL-6/（ng·L-1）250.31±39.66 872.65±59.14①304.26±42.92①②332.41±41.51①②TNF-α/（ng·L-1）230.32±36.81 1 900.15±53.24①840.52±44.37①②912.56±47.21①②MDA/（nmol·mg-1）11.19±1.32 19.85±1.23①14.01±1.36①②14.18±1.29①②GSH-Px/（U·mg-1）96.25±9.82 40.18±6.79①75.42±8.32①②70.65±7.95①②

2.6 各組大鼠腦組織Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平比較圖4 結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平降低（P＜0.05），GSK-3β磷酸化水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，尼莫地平組、益氣活血組大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin 蛋白表達水平升高（P＜0.05），GSK-3β磷酸化水平降低（P＜0.05）。

圖4 各組大鼠腦組織Wnt/β-catenin信號通路蛋白表達水平比較Figure 4 Comparison of expression levels of proteins in Wnt/β-catenin signaling pathway in brain tissues between various groups of rats

3 討論

缺血性腦中風是指由于多種因素導致腦部血液循環(huán)障礙、腦供血不足，導致腦組織缺血缺氧、損傷、壞死的疾病，屬于中醫(yī)“中風”范疇[10-11]。中醫(yī)研究領(lǐng)域認為，缺血性腦中風以元氣虧虛為本、以血瘀為標，以益氣活血為治療原則[12-13]。既往臨床研究表明，黃芪注射液、川芎嗪注射液對腦血管意外后神經(jīng)功能缺損、腦神經(jīng)元的損傷具有改善作用，可提高患者生存質(zhì)量[14-17]。本研究通過建立缺血性腦中風大鼠模型，觀察黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍對腦神經(jīng)元的治療機制，探討益氣活血法的保護作用。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，益氣活血組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低，且呈現(xiàn)出時間依賴性。HE染色結(jié)果顯示，益氣活血組大鼠腦神經(jīng)損傷明顯減輕，腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)基本正常，細胞排列較為有序，細胞膜基本完整。TUNEL 染色結(jié)果顯示，益氣活血組大鼠腦組織可見少量TUNEL 陽性染色神經(jīng)元，神經(jīng)元凋亡率顯著低于模型組。以上結(jié)果表明，黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍可顯著改善缺血性腦中風大鼠急性期的神經(jīng)功能受損癥狀，減輕腦神經(jīng)元損傷和凋亡。

有研究表明，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)作為腦缺血發(fā)病過程中的關(guān)鍵分子機制，其在缺血性腦疾病中的重要作用已得到共識，針對這些機制進行靶向治療顯示出較好的神經(jīng)保護作用[18-19]。Li 等[20]研究表明，抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)能夠抑制腦缺血造成的神經(jīng)細胞凋亡，并可有效減輕腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損。本研究結(jié)果顯示，益氣活血組大鼠腦組織中IL-6、TNF-α、MDA 含量較模型組顯著降低，GSH-Px、SOD 活性較模型組顯著升高，表明黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍可顯著抑制缺血性腦中風急性期大鼠腦組織的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Bcl-2和Bax是調(diào)控細胞凋亡的關(guān)鍵基因，Bax過表達可促進細胞凋亡，而Bcl-2 可與Bax 形成二聚體抑制Bax 基因的表達，從而抑制細胞凋亡，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡因子Caspase-3及其家族的其他因子，引起衰老和凋亡的發(fā)生[21]。在本研究中，黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍治療可使缺血性腦中風大鼠腦組織Bax、Caspase-3 mRNA表達顯著降低，Bcl-2 mRNA 表達升高，表明該配伍可顯著抑制缺血性腦中風急性期大鼠腦神經(jīng)元的凋亡。

Wnt/β-catenin 信號通路在缺血性腦中風神經(jīng)血管單元保護中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用[22]。Wnt/β-catenin信號通路不僅可以調(diào)節(jié)腦血管生成、血-腦脊液屏障形成及其生物學特征的維持[23]，還參與了調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后缺血周邊的血管新生[24]。有研究表明，Wnt信號通路在缺血性腦損傷的修復過程中和神經(jīng)血管穩(wěn)態(tài)重構(gòu)中起重要的調(diào)控作用[25]。Wnt3a、β-catenin、GSK-3β 是Wnt 信號通路的關(guān)鍵信號分子。Wnt3a 主要促進神經(jīng)干細胞的分化[26]。在成年大鼠大腦中，β-catenin、GSK-3β 在整個腦組織中都有表達，大多數(shù)都表達于神經(jīng)元細胞中[27]。腦缺血時，β-catenin 穩(wěn)定性下降，上調(diào)β-catenin 可抑制缺血誘導的神經(jīng)元凋亡、促進神經(jīng)發(fā)生以及維持血腦屏障的穩(wěn)定性，對缺血性腦損傷起修復作用[28]。GSK-3β 蛋白對缺血性腦損傷的細胞凋亡則起促進作用[29]。本研究結(jié)果顯示，缺血性腦中風大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達顯著降低，GSK-3β磷酸化水平升高，經(jīng)過黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍治療后，大鼠腦組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達水平升高，GSK-3β磷酸化水平降低，表明該配伍可通過上調(diào)腦組織Wnt3a、β-catenin表達，抑制GSK-3β過度活化對缺血性腦中風大鼠起腦保護作用。

綜上所述，本研究以益氣活血法為原則，采用黃芪注射液和川芎嗪注射液配伍治療缺血性腦中風急性期大鼠，可減輕神經(jīng)功能損傷，改善腦神經(jīng)元凋亡，抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機制可能與調(diào)控腦組織Wnt/β-catenin通路有關(guān)。