基于腫瘤數據庫分析THBS2 基因mRNA 在人惡性胸膜間皮瘤的表達及意義

李 彬，李素芬，楊 娜，熊 偉*

（1.大理大學基礎醫(yī)學院，云南大理 671000；2.云南省高校臨床生物化學檢驗重點實驗室，云南大理 671000）

惡性胸膜間皮瘤（malignant pleural mesothelioma，MPM）為侵襲性高的罕見惡性腫瘤〔1〕。據報道MPM 的發(fā)病主要與石棉接觸相關，由于發(fā)達國家曾有悠久的石棉使用歷史，發(fā)展中國家目前仍在使用及生產石棉，因此MPM 的發(fā)病率在世界范圍內仍在逐年升高，發(fā)達國家中英國、澳大利亞等國發(fā)病率最高，發(fā)展中國家中中國發(fā)病率最高，其中，國內發(fā)病率最高地區(qū)為云南省〔2-3〕。由于MPM 發(fā)病罕見，且目前診斷的通用檢查指標是CT 或胸腔鏡活檢〔4〕，缺乏早期的診斷方法及標志物，因此無法檢出早期的MPM 患者，導致了MPM 患者的預后較差〔5〕。因此，探索MPM 的發(fā)病機制，尋找輔助早期診斷的生物標志物，對于提高患者的生存率至關重要。

血小板反應蛋白（thrombospondin，THBS）又稱凝血酶敏感蛋白，其家族由THBS1、THBS2、THBS3、THBS4 和THBS5 5 個成員組成，是一種具有多個結構域的鈣離子相關糖蛋白〔6〕。THBS2 是由內皮細胞、免疫細胞和基質成纖維細胞產生的一種鈣結合蛋白，THBS2 參與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的構建，可以與各種細胞表面受體、細胞因子、生長因子和蛋白酶相互作用〔7-8〕，廣泛參與血管形成、細胞骨架的構成、細胞運動及凋亡等多種生物學進程〔9〕。目前研究發(fā)現，THBS2 基因在結直腸癌、甲狀腺癌、胃癌和肝細胞癌等多種腫瘤組織和血清中高表達，并且與腫瘤進展和患者總體存活率密切相關。本研究基于多個腫瘤數據庫分析MPM組織中THBS2 基因的表達水平及其與MPM 患者臨床病理參數之間的關系，為MPM 的臨床診斷、基因治療及預后分析提供理論參考依據。

1 資料與方法

1.1 利用Oncomine 數據庫分析基因在MPM 組織及正常組織中的表達Oncomine （ https：//www.oncomine.org）是大型腫瘤基因芯片數據庫，可進行不同腫瘤及正常組織中基因的表達差異分析，同時生成可視化圖譜。在Oncomine 數據庫中設置搜索條件為：“Gene：THBS2”“Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis”“Cancer Type： Other Cancer：Mesothelioma -Pleural Malignant Mesothelioma”“SampleType：ClinicalSpecimen”，以獲取Gordon等〔10〕對MPM 的相關基因芯片研究數據并進行分析。

1.2 獲取TCGA 數據庫中MPM 數據使用R 4.0.2 軟件，利用“cgdsr”函數包從美國公共癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數據庫（http：//tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）中下載MPM 數據集“meso_tcga_pan_can_atlas_2018”，從中獲取SeqV2 代測序的mRNA 的表達結果“meso_tcga_pan_can_atlas_2018_rna_seq_v2_mrna”，將兩組數據通過對應的TCGA 病例ID 進行合并和預處理，刪除缺失數據。

1.3 TCGA 數據庫MPM 數據集的處理及臨床病理參數的相關性分析通過R 4.0.2 軟件，使用“Epicalc”函數包分析MPM 數據集，其中包含87 例MPM 的樣本病例。根據測序結果分析，MPM 組織樣本中THBS2 基因的表達量為363.125～94 156.8，中位數為11 676.7，以該基因表達量中位數為分界點，樣本THBS2 基因表達量低于中位數，定義為THBS2 低表達；反之，定義為THBS2 高表達。根據中位數分組，MPM 組織中THBS2 高表達組包含43例，低表達組包含44 例，進行臨床病理參數的相關性分析。

1.4 利用UALCAN 數據庫可視化分析MPM 臨床病理相關性UALCAN（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個有效的惡性腫瘤數據在線挖掘和分析的網站，主要是基于TCGA 數據庫中的相關惡性腫瘤數據提供隊列數據的分析。可用于分析腫瘤和正常組織之間基因的相對轉錄表達，以及轉錄表達與臨床病理參數的關聯〔11〕。使用UALCAN 的“表達分析”模塊和“MPM”數據集獲得了THBS2 基因的表達數據。分析THBS2 基因在MPM 組織中的表達量與臨床病理參數的相關性，并進行可視化分析。

1.5 THBS2 基因mRNA 表達量與MPM 患者預后的相關性使用R 4.0.2 軟件“survival”和“survminer”函數包構建Kaplan-Meier 模型并進行Log-rank 法檢驗，探究THBS2 基因mRNA 表達水平與MPM 患者總體生存率（overall survival，OS）及無疾病進展生存率（disease-free survival，DFS）之間的關聯。

1.6 THBS2 基因與其他MPM 標志物基因及THBS家族成員基因表達的相關性目前已知的MPM 腫瘤標志物分別是表皮生長因子含腓骨樣胞外基質蛋白1 （epidermal growth factor containing fibulin like extracellular matrix protein 1，EFEMP1）、間皮素（mesothelin，MSLN）、鈣結合蛋白2（calcium binding protein 2，CALB2）、硫酸酯酶1（sulfatase 1，SULF1）、鈣粘蛋白11（cadherin 11，CDH11）和鋅指蛋白FOG 家族成員2（zinc finger protein，FOG family member 2，ZFPM2）等6 種〔11〕。此外，THBS基因家族還有其他4 個基因，分別為THBS1、THBS3、THBS4 和THBS5。通 過GEPIA2 數 據 庫（http：//gepia2.cancer-pku.cn/）在線檢索和可視化分析THBS2 基因表達與其他基因表達的相關性。

1.7 統計分析建立MPM 患者的臨床病理數據集，將患者的臨床病理數據進行賦值，采用R 4.0.2軟件中的函數包進行分析及繪圖。正常組織和MPM組織中THBS2 基因表達水平的組間比較采用t 檢驗，用χ2檢驗及Fisher 精確概率法分析收集到的臨床病理因素。生存分析使用Kaplan-Meier 模型和Log-rank 法檢驗。單因素和多因素分析使用COX回歸模型。基因表達的相關性采用Pearson 法進行分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 THBS2 基因在正常肺組織、正常胸膜組織及MPM 組織中的表達差異通過Oncomine 數據庫分析THBS2 基因在正常肺組織、正常胸膜組織及MPM 組織中的mRNA 表達。結果表明，THBS2 基因在MPM 組織中的表達均明顯高于正常肺組織及正常胸膜組織，差異倍數為2.368，組間差異顯著，具有統計學意義（t＝3.185，P=0.004）。見圖1。

圖1 THBS2 基因在MPM 組織與正常組織中的表達差異

2.2 MPM 組織中THBS2 基因mRNA 表達量與臨床病理參數相關性從TCGA 數據庫獲取并整理得到的87 例MPM 臨床資料中，患者年齡28～81歲，中位年齡64 歲；男性71 例，女性16 例，統計相關的臨床病理參數。THBS2 基因mRNA 表達量與MPM 患者的年齡、性別、AJCC 分期、T 分期、N 分期、M 分期和腫瘤類型等臨床病理參數之間差異均無統計學意義。見表1。

表1 THBS2 基因mRNA 表達量與臨床病理參數的相關性（n=87）

2.3 MPM 組織中THBS2 表達量與臨床病理參數之間的關系利用UALCAN 數據庫可視化分析THBS2 基因表達量與MPM 組織中的TP53 突變、腫瘤類型、AJCC 分期、N 分期之間的相關性。結果表明，MPM 患者中THBS2 基因表達量在腫瘤N0 與N3 分期、N2 與N3 分期、N1 與N3 分期之間差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 THBS2 基因mRNA 在不同臨床病理參數的MPM 組織中表達量

2.4 THBS2 基因mRNA 表達量對MPM 患者預后的影響通過R 4.0.2 軟件構建Kaplan-Meier 生存模型并進行Log-rank 檢驗。結果表明，MPM 患者THBS2 基因mRNA 表達量對于患者的OS 有顯著影響（P=0.015），THBS2 基因高表達組的中位生存時間相對于低表達組明顯縮短（15.4 月vs. 24.1月）。見圖3A。同時，THBS2 基因mRNA 的高表達預示著MPM 患者的DFS 較差（P=0.029），THBS2 基因mRNA 高表達組的中位生存時間相對于低表達組明顯縮短（12.7 月vs.18.0 月）。見圖3B。THBS2基因mRNA 的高表達預示著MPM 患者的預后不良。

圖3 THBS2 基因mRNA 表達量對MPM 患者預后的影響

2.5 影響MPM 患者預后因素的單因素及多因素分析對87 例MPM 患者的臨床病理信息構建COX回歸模型。單因素分析結果顯示，THBS2 基因表達量、腫瘤類型與MPM 患者預后之間具有顯著相關性（P＜0.05），將上述有統計學意義的因素納入多因素回歸分析。多因素回歸分析結果提示，THBS2 基因高表達與腫瘤類型均是影響MPM 患者預后的獨立因素（P＜0.05），其中腫瘤類型為上皮樣型的MPM患者預后優(yōu)于非上皮樣型MPM 患者（HR＜1.0）。見表2。

表2 影響MPM 患者預后的臨床病理參數單因素和多因素分析

2.6 THBS2 基因與MPM 腫瘤標志物和其他THBS基因家族成員表達的相關性通過GEPIA2 數據庫在線可視化分析MPM 腫瘤標志物基因EFEPM1、MSLN、CALB2、SULF1、CDH11、ZFPM2 與THBS2 基因表達的相關性。結果顯示，THBS2 基因與CDH11基因的表達呈正相關（R＞0），差異有統計學意義（P＜0.01）；與CALB2 和MSLN 基因的表達呈負相關（R＜0），差異有統計學意義（P＜0.01）；與EFEMP1、SULF1 和ZFPM2 基因的表達差異無統計學意義。見圖4。此外，THBS 基因家族還有其他4 個成員THBS1、THBS3、THBS4 和THBS5，對THBS2 基因與它們的基因表達也進行相關性分析。結果表明，THBS2 基因的表達與THBS1、THBS3、THBS4 基因表達呈正相關（R＞0），差異有統計學意義（P＜0.05）；與THBS5 基因表達差異無統計學意義。見圖5。

圖4 THBS2 基因與MPM 腫瘤標志物基因的表達相關性分析

圖5 THBS2 基因與THBS 基因家族其他成員的表達相關性分析

3 討論

MPM 是一種罕見的惡性侵襲性腫瘤，起源于胸膜腔的間皮細胞。MPM 潛伏期長、病死率高，早期無特異性臨床表現，因此大多數患者被確診時已是晚期〔12〕，后續(xù)治療無顯著療效。MPM 早發(fā)現、早診斷和早治療等環(huán)節(jié)的技術比較欠缺，缺乏特異性高的腫瘤生物標志物。THBS2 作為一種ECM 蛋白，參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，其與惡性腫瘤的關系一直是研究的熱點。THBS2 屬于由內皮細胞、免疫細胞和基質成纖維細胞分泌的基質細胞鈣結合糖蛋白家族的一員，其與各種細胞表面受體、細胞因子、生長因子和蛋白酶相互作用，參與運動、趨化性、血管抑制、傷口愈合和細胞基質黏附等過程〔12〕。目前，有關THBS2 基因在多種不同類型腫瘤中的表達及作用的研究結果尚存在爭議。一方面，有研究報道THBS2 基因在非小細胞肺癌〔13〕、胰腺癌〔14-15〕、結直腸癌〔16〕等腫瘤中顯著高表達。另一方面，還有研究報道THBS2 基因在胃癌〔17-18〕、宮頸癌〔19〕、乳腺癌〔20〕等腫瘤中呈現顯著低表達。THBS2 基因表達與MPM 發(fā)生發(fā)展的關系鮮見報道。本研究主要基于多個腫瘤數據庫進行數據挖掘，通過R 軟件進行統計分析，探討THBS2 基因表達量與MPM 患者臨床病理參數相關性及其預后意義，并與已發(fā)現的MPM 腫瘤標志物基因進行基因表達相關性分析。研究結果顯示，相較于正常肺組織和胸膜組織，在MPM 組織中THBS2 基因的表達量呈現顯著增高，結果提示THBS2 可能是與MPM 發(fā)生發(fā)展相關的一個癌基因。通過構建Kaplan-Meier 生存分析結果顯示，THBS2 基因的表達量與MPM 患者的預后負相關，THBS2 基因高表達的MPM 患者OS 和DFS均顯著降低。通過構建COX 回歸模型，結果提示THBS2 基因高表達及非上皮樣型MPM 是獨立的危險因素，導致MPM 患者的預后不良。綜上所述，THBS2 基因有望作為MPM 的診斷基因，通過檢測患者體內THBS2 基因的表達水平，協助臨床的早期診斷和預后判斷。有研究指出，根據MPM 患者的不同臨床病理分型，上皮樣型的MPM 患者約占所有MPM 患者的80%，且上皮樣型患者的預后明顯優(yōu)于雙相混合型及肉瘤型患者〔21-22〕，這與本研究結果完全一致。結合其他文獻的報道〔11〕，本研究發(fā)現MPM 腫瘤標志物CDH11 基因與THBS2 基因的表達呈顯著正相關，CALB2 和MSLN 基因與THBS2基因的表達呈顯著負相關。此外，THBS 基因家族3個成員THBS1、THBS3、THBS4 的表達與THBS2 基因的表達均呈顯著正相關。以上結果提示，MPM 的發(fā)生和進展過程較為復雜，是一個多基因共同作用的結果。因此，探索MPM 的發(fā)病機制，研究基因表達量與MPM 患者臨床病理特征的相關性，改善MPM患者的預后仍是今后臨床研究需要探索的方向。

本研究基于腫瘤數據庫進行生物信息學分析，樣本量相對較大，可信度較高，有一定的參考價值，但是本研究僅局限于mRNA 水平上的研究，缺乏蛋白質水平檢測。在后續(xù)研究中，可通過在臨床中采集MPM 樣本，利用免疫組化和蛋白質印跡法等實驗探明THBS2 在MPM 組織中的蛋白質表達水平。同時通過體外實驗，構建敲低或過表達THBS2 基因的細胞模型，進一步驗證其對MPM 細胞生長、增殖和凋亡的影響，或者通過藥物實驗，探索和制備THBS2 的小分子抑制劑和單克隆抗體，以期對MPM的臨床診療及預后評估提供潛在的新基因靶標。