美洲大蠊多肽PAE2 基于AMPK 調控自噬逆轉BEL-7402/5-FU 多藥耐藥的體外研究

歐 玲，李彩琳，李銀蕊，周 杰，單婉歆，吳定宇，彭 芳*

（1. 大理大學藥學院，云南大理 671000；2.云南省昆蟲生物醫藥研發重點實驗室，云南大理 671000；3.大理大學資產與實驗室管理處，云南大理 671000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大惡性腫瘤，每年約有70 萬人死于HCC〔1-2〕。在我國，HCC 占肝癌85%～90%〔3〕。目前，臨床除化療外，常采用手術治療、放療、生物治療等多種方法聯合治療肝癌，其中化療是臨床治療肝癌的重要手段，但腫瘤細胞在接受常規的化療藥物治療后通常會產生耐藥，甚至具有多藥耐藥性（multi-drug resistance，MDR）〔4〕。因此，尋找治療性生物靶標成為近年來腫瘤治療的熱點。腺苷-磷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）是真核細胞中重要的能量感受器之一，對細胞內的AMP/ATP 比值非常敏感，任何導致該比值升高的因素均可激活AMPK，活化的AMPK 可參與調節自噬過程〔5〕。細胞自噬是一種溶酶體依賴的自我消化過程，多項研究表明，自噬可雙向調節MDR，抑制自噬可能增強耐藥腫瘤細胞對化療藥物的敏感性〔6-7〕。

中藥具有多靶點、多層面的特點，在逆轉腫瘤MDR 方面具有獨特的優勢〔8〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.為昆蟲綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用〔9-10〕。課題組前期以美洲大蠊為原料提取分離得到脫脂膏和CⅡ-3，進一步對CⅡ-3 進行分離得到多肽PAE2，研究表明，PAE2具有抗肝癌和逆轉肝癌多藥耐藥作用，其相關機制與影響耐藥相關蛋白及酶表達從而減少藥物排出、促進細胞凋亡以及抑制血管生成有關〔11-13〕。然而，PAE2調節自噬的機制尚不清楚。因此，本研究采用人肝癌細胞株BEL-7402 及其耐藥株BEL-7402/5-FU為試驗對象，以索拉非尼為陽性對照藥，以AMPK為靶點探討美洲大蠊多肽PAE2對自噬的影響。

1 材料

1.1 儀器TCS SP8 型激光共聚焦顯微鏡（德國Leica 公司）；TD3 型臺式低速離心機（湖南湘儀實驗儀器開發有限公司）；CKX41SF 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）；SN255939 型全自動酶標儀、3111 型CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；785BR15145 型PCR 儀（美國Bio-Rad）。

1.2 藥品與試劑美洲大蠊多肽PAE2（白色凍干粉末，批號：P18267，純度≥98%）由大理大學藥學院張成桂博士提供；索拉非尼（批號：819C021，純度≥99%）、噻唑藍（MTT，批號：C0009-2）、青鏈霉素混合液（100X，批號：20190905）、DAB 濃縮液（批號：20181120）均購自北京索萊寶科技有限公司；甘油（批號：20200414）購自昆明遠方生物制品有限公司；五氟尿嘧啶（5-FU，批號：#WXBC0190V）、二甲基亞砜（DMSO，批號：RNBD6084）均購自Sigma 公司；RPMI-1640 培養基（批號：8521447）、胎牛血清（FBS，批號：18050302）、牛血清白蛋白（BSA，批號：15260-037）均購自美國Gibco 公司；DAPI（批號：MAO128-Jul-14F）購自美侖生物；0.25% 胰蛋白酶-EDTA（批號：MSTE1905X）購自邁基生物技術有限公司；AMPK 試劑盒（批號：201890901）購自江蘇晶美生物科技有限公司；AICAR（批號：A818441337769）購自愛普拜生物技術有限公司；BeyoIIcDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：081220200922/0761819083）、BeyoFastTMSYBR GREEN qPCR Mix（批號：121919200527）均購自碧云天生物技術有限公司。

1.3 細胞人肝癌細胞株BEL-7402 （批號：MXC050）、人肝癌耐藥細胞株BEL-7402/5-FU（批號：MXC049）均購于上海美軒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養BEL-7402、BEL-7402/5-FU 細胞用含10% FBS 和1%青鏈霉素的RPMI-1640 培養基在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養，另在BEL-7402/5-FU 細胞的培養基中加入20 μg/mL 的5-FU 以維持其耐藥性。2 種細胞均要1～2 d 更換培養基，長滿培養皿80%以上進行傳代，選擇對數生長期細胞進行試驗。

2.2 藥液制備美洲大蠊多肽PAE2用磷酸鹽緩沖液（PBS）制成50 mg/mL 的儲備液，索拉非尼用DMSO 配制成10 mg/mL 的儲備液，用0.22 μm 醫用微孔濾膜過濾除菌后分裝，4 ℃冰箱保存備用，試驗時用0.9%氯化鈉溶液稀釋至相應濃度后進行給藥。

2.3 分組與給藥試驗分為敏感組、耐藥組、索拉非尼組、PAE2低劑量組、PAE2中劑量組、PAE2高劑量組、PAE2低劑量聯合AICAR 組、PAE2中劑量聯合AICAR 組、PAE2高劑量聯合AICAR 組。索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2劑量參照文獻〔14〕，AICAR 作用濃度由MTT 試驗確定。敏感組加入BEL-7402 細胞，其余各組加入BEL-7402/5-FU 細胞。給藥時，敏感組和耐藥組加入常規培養基，給藥組則加入含相應藥物的培養基。

2.4 MTT 比色法檢測AICAR 的作用時間及濃度取對數生長期的BEL-7402/5-FU 細胞接種于96 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養過夜后，加入含不同濃度的AICAR 培養基，每個濃度設10 個復孔，每孔100 μL，同時設置試劑對照組和細胞空白對照組。培養48 h 后每孔加入20 μL MTT，繼續培養4 h，終止培養。每孔加入100 μL DMSO，振蕩30 min，待紫色結晶完全溶解后，酶標儀測570 nm 處OD 值（OD570）。計算AICAR 對BEL-7402/5-FU 細胞的生長抑制率，處理數據得20%抑制濃度（IC20），以IC20作為試驗劑量與美洲大蠊多肽PAE2不同劑量聯合用于進行后續試驗。

2.5 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測AMPK 的含量檢測敏感組，耐藥組，索拉非尼組，PAE2低、中、高劑量組AMPK 含量。敏感組取對數生長期的BEL-7402 細胞，其余各組取對數生長期的BEL-7402/5-FU 細胞，接種于96 孔板中，待細胞生長融合至70%左右，除敏感組和耐藥組外，其余各組分別加入相應藥物。于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養48 h，培養結束后取細胞培養液2 500 r/min 離心10 min，取上清，按照試劑盒說明書進行檢測。

2.6 實時聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測AMPK mRNA 的表達Trizol 試劑提取總RNA，測定其濃度與純度，按照cDNA 第一鏈合成試劑盒說明合成cDNA，以cDNA 為模板采用兩步法進行擴增。反應程序：預變性（95 ℃2 min）；PCR 反應（40 個循環；95 ℃15 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s）。增加溶解曲線步驟：95 ℃15 s，60 ℃30 s。選擇GAPDH 為內參，2-△△Ct法計算AMPK mRNA 表達水平。

2.7 real-time PCR 檢測細胞自噬相關因子mRNA的表達以GAPDH 為內參，兩步法進行擴增，2-△△Ct法計算細胞中自噬相關蛋白5（autophagy related protein 5, ATG5）、自噬相關蛋白7（autophagy related protein 7, ATG7）、磷酸肌醇-3-激酶3（phosphoinositide-3-kinase class 3, PIK3C3）、Beclin 1、微管相關蛋白1 親鏈3-Ⅱ（microtubuler-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ, LC3-Ⅱ）、P62、Zeste 同源物增強子2（enhancer of Zeste homolog 2, EZH2）的mRNA 相對表達水平。引物序列見表1。

表1 real-time PCR 引物序列

2.8 激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白的表達取對數生長期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細胞，接種至預先放有細胞爬片的24 孔板中，常規培養24 h 后加入含相應受試藥物的培養基繼續培養48 h。每孔加入冰丙酮300 μL，室溫固定15 min；5% BSA 封閉60 min。一抗孵育過夜，二抗孵育2 h。DAPI 避光染色10～15 min。抗熒光淬滅封片劑封片，獨立重復試驗3 次，避光保存。第2 天于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察，每組6 個平行。

2.9 免疫細胞化學法（immunocytochemistry，ICC）檢測P62 蛋白的表達取對數生長期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 細胞，接種至預先放有細胞爬片的12 孔板中，常規培養24 h 后加入含相應受試藥物的培養基繼續培養48 h。3% H2O2與甲醇按1∶4 的體積比均勻混合后滴入各爬片上，室溫孵育30 min；5% BSA 室溫封閉10 min；一抗、二抗孵育；DAB 顯色試劑盒顯色至所需棕色后加入蒸餾水終止反應；蘇木素復染30 s，將標本放入飽和Na2HPO4溶液中浸泡2 min，取出后立即用蒸餾水清洗；乙醇梯度脫水，甘油封片，倒置顯微鏡下觀察拍照。使用Image J 6.0 軟件計算平均光密度值。

2.10 統計分析采用SPSS 17.0 統計軟件進行數據處理，所得數據均采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗，檢驗水準α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 AICAR 的作用時間及濃度采用MTT 法對AMPK 激活劑AICAR 的作用時間及濃度進行檢測，結果發現，AICAR 對細胞的殺傷呈時間和濃度依賴，后續細胞試驗中與美洲大蠊多肽PAE2不同劑量組聯合使用的濃度為IC20，作用時間為48 h。經計算，激活劑AICAR 作用濃度為0.006 mmol/L，即1.55 mg/mL（分子量為258.23）。見封三圖1。

3.2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響與敏感組相比，耐藥組細胞中AMPK 含量明顯增多（P＜0.05），PAE2高劑量組細胞中AMPK 含量明顯降低（P＜0.05）；與耐藥組相比，索拉非尼組、PAE2各劑量組細胞中AMPK 含量均顯著降低（P＜0.05）；與索拉非尼組相比，PAE2各劑量組中AMPK含量均降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響（±s，n=8，pg/mL）

表2 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK 含量的影響（±s，n=8，pg/mL）

注：與敏感組比較*P ＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05。

組別 AMPK 含量敏感組 135.82±9.27耐藥組 147.40±5.67*索拉非尼組 132.29±7.55#PAE2 低劑量組 128.41±8.08#PAE2 中劑量組 128.72±11.50#PAE2 高劑量組 126.10±8.12*#

3.3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響與敏感組相比，耐藥組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05），索拉非尼組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與耐藥組相比，索拉非尼組細胞中AMPK mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），PAE2各劑量組細胞中AMPK mRNA 表達水平也有不同程度降低，以PAE2高劑量組效果最佳（P＜0.05），但效果不及索拉非尼。見表3。

表3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響（±s，n=4）

表3 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞中AMPK mRNA表達水平的影響（±s，n=4）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05。

組別 AMPK mRNA敏感組 0.72±0.11耐藥組 1.00±0.00*索拉非尼組 0.10±0.02*#PAE2 低劑量組 0.91±0.12▲PAE2 中劑量組 0.87±0.25▲PAE2 高劑量組 0.63±0.13#▲

3.4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關因子mRNA 表達水平的影響與敏感組相比，耐藥組ATG5 mRNA、ATG7 mRNA 和PIK3C3 mRNA 表達水平均升高，且PIK3C3 mRNA 的表達水平差異有統計學意義（P ＜0.05）。與耐藥組相比，PAE2各劑量組ATG5 mRNA 和PIK3C3 mRNA 表達水平均明顯降低（P＜0.05），ATG7 mRNA 表達水平也降低，但僅PAE2中劑量組的差異有統計學意義（P＜0.05）。PAE2聯合AICAR 給藥后，ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA 表達水平見表4。

表4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

表4 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05。

組別 ATG5 mRNA ATG7 mRNA PIK3C3 mRNA敏感組 0.85±0.11 0.80±0.07 0.49±0.09耐藥組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00*索拉非尼組 0.25±0.05*# 1.12±0.21* 0.29±0.05*#PAE2 低劑量組 0.78±0.22#▲ 0.91±0.26 0.53±0.07#▲PAE2 中劑量組 0.47±0.08*#▲ 0.53±0.06#▲ 0.20±0.07*#PAE2 高劑量組 0.48±0.05*#▲ 0.82±0.07▲ 0.67±0.14*#▲PAE2 低劑量聯合AICAR 組 1.04±0.10*▲ 0.70±0.14#▲ 0.14±0.03*#▲PAE2 中劑量聯合AICAR 組 1.11±0.19*▲ 1.14±0.08* 0.28±0.05*#PAE2 高劑量聯合AICAR 組 0.36±0.09*# 1.26±0.17*# 0.21±0.04*#

與敏感組相比，耐藥組Beclin 1 mRNA 和LC3-ⅡmRNA 表達水平明顯升高（P＜0.05），P62 mRNA和EZH2 mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）。與耐藥組相比，PAE2各劑量組Beclin 1 mRNA 和LC3-ⅡmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），P62 mRNA和EZH2 mRNA 水平顯著升高（P＜0.05）。與PAE2單用相比，PAE2低、高劑量聯合AICAR 組P62 mRNA的表達水平顯著降低（P＜0.05），PAE2低、中、高劑量聯合AICAR 組EZH2 mRNA 的表達水平均顯著降低（P＜0.05），PAE2低、中劑量聯合AICAR 組LC3-II mRNA 的表達水平顯著升高（P＜0.05）。見表5。

表5 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關因子Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA、P62 mRNA、EZH2 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

表5 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬相關因子Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA、P62 mRNA、EZH2 mRNA表達水平的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05；與PAE2 單用比較△P＜0.05。

組別 Beclin 1 mRNA EZH2 mRNA敏感組 0.25±0.05 4.53±0.39耐藥組 1.00±0.00* 1.00±0.00*索拉非尼組 0.13±0.01*# 0.72±0.38*PAE2 低劑量組 0.03±0.00*#▲ 9.04±0.22*#▲PAE2 中劑量組 0.06±0.01*#▲ 3.55±0.62*#▲LC3-ⅡmRNA 0.59±0.06 1.00±0.00*0.30±0.03*#0.15±0.07*#▲0.29±0.07*#P62 mRNA 1.86±0.25 1.00±0.00*0.14±0.02*#8.09±1.15*#▲1.35±0.15#0.38±0.08*# 8.67±0.70*#▲PAE2 低劑量聯合AICAR 組 0.05±0.01*#▲ 0.99±0.05*▲△ 0.52±0.05*△ 0.72±0.10*△PAE2 中劑量聯合AICAR 組 0.05±0.01*#▲ 0.55±0.03#▲△ 0.86±0.13*▲ 1.47±0.29*#▲△PAE2 高劑量組 0.16±0.04*# 9.29±0.32*#▲PAE2 高劑量聯合AICAR 組 0.07±0.01*#▲ 0.69±0.15*△0.29±0.03*#0.41±0.08*#△

3.5 美洲大蠊多肽PAE2 對LC3-Ⅱ蛋白的影響為了探究美洲大蠊多肽PAE2對自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的影響，運用激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ蛋白在各組細胞中的表達。兩種熒光融合后，與敏感組相比，耐藥組細胞自噬作用降低，PAE2各劑量組給藥后自噬作用明顯降低；PAE2聯合AICAR給藥后，細胞中綠色熒光明顯增多，自噬作用增強。

3.6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響ICC 結果顯示，敏感組細胞大量表達P62，其余各組細胞P62 表達減少，索拉非尼和PAE2均對P62有促進作用，且PAE2作用優于索拉非尼。PAE2聯合AICAR 給藥后，P62 表達減少。見封三圖2。與敏感組相比，耐藥組細胞中P62 表達明顯降低（P＜0.05），提示耐藥細胞自噬作用增強；與耐藥組相比，索拉非尼組和PAE2各劑量組P62 表達均顯著增加（P＜0.05），表明藥物對細胞自噬起到了抑制作用。PAE2聯合AICAR 給藥后，P62 表達明顯降低（P＜0.05），即AICAR 激活AMPK 使細胞自噬作用增強。見表6。

表6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響（±s，n=8）

表6 美洲大蠊多肽PAE2 對細胞自噬蛋白P62 的影響（±s，n=8）

注：與敏感組比較*P＜0.05；與耐藥組比較#P＜0.05；與索拉非尼組比較▲P＜0.05；與PAE2 單用比較△P＜0.05。

組別 P62敏感組 0.16±0.01耐藥組 0.09±0.01*索拉非尼組 0.11±0.01*#PAE2 低劑量組 0.12±0.00*#PAE2 中劑量組 0.13±0.01*#▲PAE2 高劑量組 0.13±0.01*#▲PAE2 低劑量聯合AICAR 組 0.09±0.01*▲△PAE2 中劑量聯合AICAR 組 0.10±0.01*▲△PAE2 高劑量聯合AICAR 組 0.10±0.01*▲△

4 討論

肝癌患者病死率較高，且因臨床診斷發現晚，手術治療效果并不理想。目前臨床上的治療手段以化療為主。索拉非尼是一種口服多靶點激酶抑制劑，具有較好的抑制腫瘤細胞生長、增殖作用，是首個被美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批準的用于治療晚期HCC 的分子抑制劑，因此本研究選擇索拉非尼作為陽性對照藥〔15〕。由于在化療過程中易出現耐藥現象，療效不佳，因此，愈來愈多的研究者對腫瘤耐藥機制及如何逆轉耐藥進行深入探索。目前臨床上使用的逆轉劑種類較多，但由于其逆轉效率不高且機制單一，應用受到限制。而中藥具有多靶點、多階段性作用的優勢，可以針對腫瘤MDR 的多種機制進行有效的逆轉。課題組前期研究〔11-13〕表明美洲大蠊多肽PAE2具有逆轉肝癌MDR 作用，但對自噬的影響未知。AMPK 是將多種細胞功能和生理過程及能量利用聯系起來的主要傳感器之一，而自噬的主要誘導因素為營養缺乏和（或）能量缺乏，在生物進化過程中，這種內在特性從未改變，所以，AMPK 是自噬的重要上游調節因子〔4〕，且可從多層面促進自噬。因此，本研究基于AMPK 影響自噬來探討PAE2逆轉腫瘤多藥耐藥作用機制。

腫瘤細胞在營養缺乏、缺氧、饑餓等壓力環境下，AMPK 被激活，從而保護細胞免于死亡。ELISA結果顯示，BEL-7402/5-FU 細胞株中AMPK 含量明顯高于BEL-7402 細胞株，差異具有統計學意義，推測這是耐藥細胞的一種保護機制，腫瘤耐藥細胞能量代謝異常，需要更多的能量。為了驗證這一結果，采用real-time PCR 檢測細胞中AMPK mRNA 的表達水平，結果顯示出與ELISA 同樣的趨勢。基于上述結果可知，耐藥細胞中AMPK 高表達，美洲大蠊多肽PAE2可抑制AMPK 的表達，且以PAE2高劑量組效果較優。

LC3-Ⅱ定位于自噬體內外膜之間，自噬體與溶酶體結合后，LC3-Ⅱ被溶酶體的水解酶降解，因此可作為自噬標記物。激光共聚焦顯微鏡觀察LC3-Ⅱ的表達，結果顯示美洲大蠊多肽PAE2可降低耐藥細胞株中LC3-Ⅱ蛋白的表達，即抑制耐藥細胞自噬。P62 是一種重要的選擇性自噬的調節劑，也是自噬底物。P62 可以和LC3-Ⅱ及自噬體內膜上的泛素化底物結合，形成自噬溶酶體被降解，自噬抑制可導致P62 積累，在HCC 的發生過程中扮演重要角色〔16〕。ICC 結果表明美洲大蠊多肽PAE2可提高耐藥細胞株中P62 蛋白的表達。哺乳動物自噬體形成涉及2 個泛素化樣修飾，即ATG12 修飾和LC3修飾〔17-18〕。ATG12 被泛素活化酶E1 樣酶ATG7 激活后轉移到泛素結合酶E2 樣酶ATG10，并與ATG5結合形成自噬體前體。Beclin 1 是哺乳動物中最先被確定的特異性自噬調控基因之一，AMPK 可直接在Thr388 處磷酸化Beclin 1，Beclin 1 中Thr388 處的磷酸化對于誘導自噬是必不可少的，同時AMPK 促進Beclin 1 與PIK3C3 的直接結合以激活自噬〔19〕。AMPK 還可以特異性磷酸化EZH2，破壞EZH2 與Zeste 12 同源物1 抑制因子2（suppressor of zeste 12 homolog，SUZ12）的相互作用，導致多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex 2，PRC2）靶基因被上調，從而抑制腫瘤細胞的生長〔20〕。real-time PCR 結果顯示，美洲大蠊多肽PAE2能夠使自噬相關因子ATG5 mRNA、ATG7 mRNA、PIK3C3 mRNA、Beclin 1 mRNA、LC3-ⅡmRNA 的表達水平降低及P62 mRNA 和EZH2 mRNA 的表達水平升高。AICAR 是AMPK 的激活劑，PAE2聯合AICAR 用藥后，AMPK被激活，細胞自噬有一定程度的增強。上述結果進一步證實了美洲大蠊多肽PAE2通過下調AMPK 的表達而抑制腫瘤細胞自噬。

雖然美洲大蠊多肽PAE2抑制了耐藥細胞的自噬，但PAE2各劑量組對細胞自噬的影響并未呈現出劑量依賴性，這可能與PAE2多靶點、多層面、多途徑的作用特點、自噬過程及腫瘤多藥耐藥的復雜性有關，也可能與PAE2未達到有效治療劑量或者超出有效濃度而出現拮抗作用有關，中藥的量效關系仍處于探索階段。此外，PAE2對P62 及其mRNA的表達均體現出上調的作用，但各劑量組之間的增強作用并不一致，在real-time PCR 結果中甚至出現PAE2低、高劑量組效果較優而中劑量組效果不明顯的情況，這可能與藥物在體外細胞中的代謝過程及腫瘤微環境的不穩定性，以及P62 在轉錄水平和翻譯水平對細胞自噬的調節作用不同有關，后續可以通過克隆、突變P62，然后進行質粒構建與重組以及細胞轉染等操作，以此來探究P62 在蛋白水平和基因水平表達不一致的原因。

綜上所述，美洲大蠊多肽PAE2可能通過抑制AMPK 而抑制自噬以達到逆轉肝癌多藥耐藥的作用。在后續研究中，需要進一步探索AMPK 對自噬是起到一般調節作用還是主導作用，PAE2作用為何未呈現劑量依賴性的原因，體外和體內試驗是否呈現相同的效果等。后續課題組也將對PAE2對自噬作用的影響進行體內研究，以進一步完善PAE2逆轉肝癌MDR 的機制，為PAE2的臨床研究奠定基礎。