HPLC 法同時測定涼粉草中四種成分的含量

莫穎華，馮白茹，毛一中

（惠州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 惠州 516025）

涼粉草（Mesona chinensisBenth.）別名仙人草、仙人凍、仙草，為唇形科植物涼粉草的全草，產(chǎn)于廣東、廣西西部、浙江、江西和臺灣等地，資源豐富［1，2］。涼粉草的活性成分有多糖、黃酮、酚類及三萜類等，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗菌等生物活性，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［3］。市場上涼粉草主要用于制備成消暑用的植物飲料和食品、具有降糖降脂等功能的口服制劑、新型凝凍劑及作為天然食用色素提取原料等［4］。目前對涼粉草的質(zhì)量研究主要集中在三萜類成分熊果酸、齊墩果酸和有機(jī)酸成分苯甲酸的含量測定［5-9］，而對涼粉草中的酚酸類成分研究較少。為了進(jìn)一步完善涼粉草的質(zhì)量控制指標(biāo)，本研究采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定涼粉草中咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷及迷迭香酸的含量，目的在于更全面地控制涼粉草化學(xué)成分的含量，為涼粉草的質(zhì)量可控制性等基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 涼粉草購自市場；咖啡酸對照品（99.7%）、迷迭香酸對照品（90.5%），中國食品藥品檢定研究院；異槲皮苷對照品（含量≥98%）、紫云英苷對照品（含量≥98%），北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；甲醇（色譜純），天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；無水乙醇（分析純），天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純），汕頭市西隴科學(xué)股份有限公司；甲酸（分析純），汕頭市西隴化工股份有限公司。

1.1.2 儀器 LC-20AR 型島津高效液相色譜儀（日本島津有限公司），Thermo ODS-2 型色譜柱［賽默飛科技（中國）有限公司］，Sartorius BSA124S 型電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］，PS-40A 型超聲波清潔機(jī)（深圳市科潔超聲科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Thermo ODS-2 HYPERSIL 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動相采用乙腈∶0.1%甲酸不同梯度洗脫（表1）；檢測波長：254 nm；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。混合對照品溶液及涼粉草樣品溶液的HPLC 色譜見圖1。

圖1 混合對照品溶液（A）及涼粉草樣品溶液（B）的HPLC色譜

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸適量，加甲醇溶解制成每毫升分別含有1.715 0、0.558 6、8.193 0、0.669 7 mg的混合對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的制備 取涼粉草粗粉1.5 g，置于100 mL 具塞三角瓶，精密加入50%乙醇25 mL，超聲提取30 min，放冷至室溫，取上清液濾過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系的考察

分別精密取混合對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于50 mL 容量瓶中，加入50%乙醇并定容至刻度，取10 μL，注入高效液相色譜儀進(jìn)行定量分析。以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸分別在 34.297～171.480 μg/mL、11.172～55.860 μg/mL、16.386～81.928 μg/mL、13.394～66.970 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。

表2 涼粉草中4 種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2 儀器精密度試驗(yàn)

取混合對照品溶液適量，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算得到咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸面積的RSD分別為0.068%、0.110%、0.200%、0.110%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批涼粉草供試品粉末6 份，按照“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，計(jì)算得到咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸面積的RSD分別為1.43%、1.38%、1.41%、0.74%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取涼粉草供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h，按“1.2.1”色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，計(jì)算得到咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷、迷迭香酸面積的RSD分別為0.10%、0.75%、0.97%、1.11%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取涼粉草粗粉1.0 g，分別加入高、中、低濃度的咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸對照品，再加入50%乙醇使總體積為25 mL，按照“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定（表3）。結(jié)果表明，9 次試驗(yàn)的咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸相對應(yīng)的平均回收率均大于95.00%，RSD均小于3.00%，說明提取工藝合理可行。

表3 涼粉草中4 種成分的加標(biāo)回收率結(jié)果

2.6 樣品含量測定

2.6.1 同一產(chǎn)地樣品成分的含量測定 取同一產(chǎn)地同一批次的涼粉草粗粉 1.0 g 各6 份，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定（表4），6 份樣品所測得咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸4 種成分含量的RSD均小于2%，說明該方法穩(wěn)定性好。

表4 同一產(chǎn)地涼粉草樣品中4 種成分的含量測定結(jié)果

2.6.2 不同產(chǎn)地樣品成分的含量測定 取7 個不同產(chǎn)地的涼粉草粗粉各1.0 g，按“1.2.3”方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定（表5），所測得咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸4種成分含量平均值略有差異。

表5 不同產(chǎn)地涼粉草中4 種成分的含量測定結(jié)果

3 小結(jié)與討論

3.1 提取方法的篩選

對涼粉草中的咖啡酸、異槲皮苷、紫云英苷和迷迭香酸的提取方法進(jìn)行了考察。以各成分的含量為考察指標(biāo)，對3 種常用的提取方法（冷浸法、回流提取法、超聲輔助提取法）進(jìn)行篩選。結(jié)果顯示，在3種提取方法中，回流提取法與超聲法提取效果相當(dāng)，考慮到實(shí)驗(yàn)室的便利性，選用超聲提取法進(jìn)行提取。

3.2 提取溶劑的確定

取涼粉草粗粉1.5 g，加入溶劑的體積為25 mL，超聲提取時間為30 min，提取次數(shù)1 次，分別以提取溶劑為甲醇、50%乙醇、無水乙醇進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，溶劑為50%乙醇時的提取效果最好，故選用50%乙醇進(jìn)行提取。

3.3 色譜條件的確定

對色譜柱Thermo ODS-2 HYPERSIL（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）、資生堂 CAPCELL PAK C18 MG（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)色譜柱Thermo ODS-2 HYPERSIL（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）對所測4 種成分的分離度好，基線平穩(wěn)；在波長210、254、320、360 nm 下檢測，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)峰在 254 nm 處普遍峰面積大、靈敏度高；考察不同的流動相（乙腈∶水、甲醇∶水、乙腈∶0.1%磷酸、乙腈∶0.1%甲酸），前2 組流動相分離度差，乙腈∶0.1%磷酸與乙腈∶0.1%甲酸的分離度相當(dāng)，但磷酸對色譜柱損害大，最終流動相為乙腈∶0.1%甲酸。

3.4 樣品含量測定結(jié)果分析

對同一產(chǎn)地同一批次樣品進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明該含量檢測方法穩(wěn)定、可靠。對7 個不同產(chǎn)地的樣品進(jìn)行含量測定，發(fā)現(xiàn)4 種成分含量會有一定的差異性，這可能由于產(chǎn)地不同、采收時間不同、光照情況不同等原因引起。