基于網絡藥理學探討中藥復方治療奶牛子宮內膜炎的作用機制

王鉞夫，徐 闖，崔一喆

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319）

奶牛子宮內膜炎（cow endometritis）是指以奶牛產后21～26 d奶牛子宮頸>7.5 cm或陰道內仍流出膿性液體甚至血液為主要特征的子宮黏膜炎癥[1]。因子宮內膜炎導致不孕而淘汰的奶牛在所有奶牛淘汰原因中占比達1/3。子宮內膜炎在繁殖障礙性疾病中占比最大，危害最高。在現代臨床獸醫學上，奶牛子宮內膜炎主要由病原微生物感染導致[2]，在所有的患病奶牛中，以細菌侵入最為常見。致病菌主要為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、變形桿菌及枯草芽孢桿菌等[3]。不同地區從患病奶牛體內分離出的致病菌和所占比率也不相同，但主要有大腸埃希菌、葡萄球菌、鏈球菌[4]。奶牛自身免疫機能下降及飼養環境污染都會造成致病菌大量繁殖，增加奶牛的發病幾率。

目前，主要依靠抗生素治療奶牛子宮內膜炎，且對發病奶牛有良好的治療作用，但抗生素使用時間過長會導致致病菌產生耐藥性，使用過于頻繁會在奶牛體內造成殘留，危害人體健康。近年來，中獸藥治療得到了廣泛的重視，由于中藥成分均來源于草本植物，避免了因抗生素頻繁使用造成的耐藥性增加及藥物殘留造成的危害，同時減少了治療費用，成為了家畜疾病治療研究的熱點。

中獸醫理論認為，奶牛子宮內膜炎屬濕熱帶下性病征，濕邪侵入胞宮,致氣血凝滯而發病[5]。在治療時應以祛瘀、活血、解毒類藥物為主[6]。丹參為寒涼性藥物，具有祛瘀活血、通經止痛等功效，屬于活血化瘀類藥物，含有丹參酮Ⅰ、ⅡB、ⅡA和隱丹參酮等大量有效活性成分[7-9]，具有良好的抗菌消炎和抗癌功能，對微管的形成也有一定的抑制作用。益母草與丹參聯用可增強活血化瘀作用[10]，促進子宮收縮，獸醫臨床上常用于促進產后惡露排出，對于產后引發的子宮炎癥也有一定的效果。李健等[11]報道以丹參為主的中藥復方制劑對奶牛子宮內膜炎有良好的治療作用。黃芩、連翹為常見的清熱解毒類藥物，其中藥復方——雙黃連常用于治療多種疾病引起的炎癥[12]。本研究根據中藥配伍原則，將丹參、益母草、連翹及黃芩組成中藥復方，通過網絡藥理學分析該中藥復方與奶牛子宮內膜炎之間的成分-靶點-通路是否存在關聯，探究該中藥復方是否對奶牛子宮內膜炎具有治療作用，以期為奶牛子宮內膜炎網絡藥理學的藥物靶點預測提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分靶點的篩選

通過TCMSP數據庫（http:∥lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）對丹參、益母草、黃芩、連翹的活性成分靶點進行檢索，藥劑最終通過機體吸收入血，將口服利用度（OB）及類藥相似度（DL）作為主要篩選條件，以OB值≥30%、DL>0.18為藥物活性成分靶點的最低標準進行篩選[13]。

1.2 藥物靶點蛋白與geneSymbol的轉化

從Uniprot（https:∥www.uniprot.org/）網站上通過UniprotKB（蛋白數據庫），以Bostaurus（普通牛）為物種檢索已被Swiss-prot驗證的蛋白數據，將藥物的靶點蛋白與已驗證的相關蛋白一一對應，并轉換為相應的geneSymbol，將轉換后靶點上傳至Cytoscape 3.8.2軟件繪制藥物成分-靶點網絡圖。

1.3 奶牛子宮內膜炎靶點的篩選

通過NCBI的gene選項及GeneCard（https:∥www.genecards.org）、OMIM數據庫（https:∥omim.org）、TTD（http:∥db.idrblab.net/ttd）、DrugBank（https:∥www.drugbank.com/）等網站將Bostaurus與endometritis（子宮內膜炎）作為檢索項，獲得與奶牛子宮內膜炎相關的基因靶點。

1.4 中藥復方治療奶牛子宮內膜炎靶點蛋白互作網絡構建

將奶牛子宮內膜炎相關的疾病基因靶點與藥物靶點蛋白進行交互，獲得兩者的交集靶點。將所得的交集靶點上傳至STRING數據庫（https:∥www.string-db.org/），建立預測中藥復方治療奶牛子宮內膜炎的靶點蛋白互作（PPI）網絡，并通過Cystoscape 3.8.2軟件對PPI網絡進行整理篩選，通過Degree篩出核心靶點。

1.5 核心靶點網絡富集分析

將預測藥物-疾病靶點中的核心靶點上傳至Metascape數據庫（https:∥metascape.org）進行GO功能與KEGG通路富集分析，將得到GO功能與KEGG通路分析的主要通路上傳至Cytoscape 3.8.2軟件，制得靶點-通路網絡圖，并通過R語言根據P值制作主要靶點通路的氣泡圖。

2 結 果

2.1 藥物活性成分靶點的篩選

從TCMSP數據庫中篩出133個藥物活性成分，其中丹參活性成分65個，以丹參酮（tanshinone）、紫草酸B（lithospermic acid B）、紫丹參萜醚（przewalskinb）等為主要成分（表1）；益母草活性成分9個，以槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、花生四烯酸（arachidonic acid）為主（表2）；連翹活性成分23個，以松脂酚（pinoresinol）、毛果蕓香堿（（+）-pilocarpine）、連翹脂素（（-）-phillygenin）、連翹苷（phillyrin）為主，同時與益母草共有槲皮素與山奈酚（表3）；黃芩活性成分36個，以黃芩苷（baicalin）、黃芩素（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）等黃酮類物質為主（表4），活性成分漢黃芩素、β-谷甾醇與連翹主要活性成分有交叉。

表1 丹參主要活性成分Table 1 Main active ingredients of Salvia miltiorrhiza

續表

表2 益母草主要活性成分Table 2 Main active ingredients of Leonurus heterophyllus

表3 連翹主要活性成分Table 3 Main active ingredients of Forsythia suspensa

表4 黃芩主要活性成分Table 4 Main active ingredients of Scutellaria baicalensis Georgi

2.2 藥物活性成分-靶點網絡

將所有藥物活性成分于與Uniprot蛋白庫進行比對，得到292個基因靶點，通過Cytoscape 3.8.2軟件繪制成分-靶點網絡圖（圖1），其中，藥物成分山奈酚、漢黃芩素、丹參酮ⅡA、鼠尾草酚酮、金合歡素、花生四烯酸、紫丹參素B、紫丹參素E、二氫丹參酮Ⅰ、紫丹參萜醚的連接度（Degree）值均>30（表5），為該中藥復方中的核心作用靶點化合物，所有基因靶點中前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）、腎上腺素能受體（ADRA1A）、熱休克蛋白90-1（HSP90-1）、PTGS1、鈉離子通道α亞單位（SCN5A）、β2腎上腺素能受體（ADRB2）和核受體輔激活因子6（NCOA6）的Degree值均>50（表6），為藥物活性成分的主要作用靶點。

圖1 藥物活性成分-靶點網絡圖Fig.1 Drug composition-target network diagram

表5 Degree>30的藥物活性成分Table 5 Active ingredients with degree greater than 30

表6 Degree>50的基因靶點Table 6 Gene targets with degree greater than 50

2.3 中藥復方治療奶牛子宮內膜炎靶點蛋白的PPI網絡構建

在NCBI、GeneCard、geneMap、TTD、DrugBank等網站獲得奶牛子宮內膜炎相關基因靶點130個，與292個藥物活性成分的基因靶點進行交互，并繪制Venn圖，得到25個交集靶點（圖2）。 通過Cytoscape 3.8.2軟件構建藥物-疾病靶點交互網絡圖（圖3），得到25個預測藥物作用于奶牛子宮內膜炎的交集靶點，將交集靶點上傳至STRING網站，獲得藥物-疾病靶點的PPI網絡圖（圖4），從圖中可知PPI網絡中包含24個節點，172條相互作用線，平均節點度為14.3，局部聚類系數為0.812。

圖2 藥物活性成分靶點與疾病靶點Venn圖Fig.2 Venn diagram of drug component targets and disease targets

圖3 藥物-疾病靶點交互網絡圖Fig.3 Drug-disease target interaction network diagram

圖4 預測藥物-疾病靶點PPI網絡圖Fig.4 PPI network for predicting drug-disease targets

2.4 核心靶點的篩選

通過Cytoscape將PPI網絡得到的結果根據Degree值大小對PPI網絡中的預測藥物作用于疾病的基因靶點進行篩選，Degree值越大靶點圖標越大，顏色越深。由圖5可知，腫瘤壞死因子（TNF）、蛋白激酶（AKT1）、PTGS2、CSC1樣蛋白（CXCL8）、細胞腫瘤抗原p53（TP53）、白細胞介素1β（IL1β）和IL6 7個靶點的圖標相對較大，顏色較深，可能為藥物治療奶牛子宮內膜炎作用的核心靶點。

2.5 靶點網絡KEGG通路與GO功能富集分析

2.5.1 GO功能富集分析 將圖5中的24個靶點上傳至Metascape數據庫進行GO功能富集分析，得到32個差異顯著條目（P<0.01）,其中生物過程（biological processes，BP）20條，細胞組分（cellular components，CC）6個，分子功能（molecular functions，MF）6個（圖6）。根據富集分數（enrichment score）大小對差異條目進行排列，富集分數越大，富集條目越顯著。生物過程分析主要包括脂多糖的反應、白細胞-細胞黏附的正向調節、對無機物的反應、細胞對化學應激的反應、發熱反應、對IL-1的反應、炎癥反應的調節、對瘤壞死因子、蛋白質磷酸化的正向調控、白細胞與血管內皮細胞黏附的正向調節、僵化、腺體發育細胞因子介導的信號通路、組織重塑、生殖結構發育、消化系統發育、上皮細胞遷移的調節、對病毒的反應、核質轉運的正向調節及干細胞分化的調控等；細胞組分分析顯示靶點主要作用于細胞膜筏、薄膜側面、顆粒分泌腔、細胞質核周區、轉錄調節復合物、膠原細胞外基質；分子功能分析得出，靶點功能主要涉及信號受體活性調節、轉錄輔激活子的結合、血紅素結合、整合素結合、磷酸酶結合、蛋白質同二聚活性調節。

圖5 根據Degree值構建的PPI網絡圖Fig.5 PPI network diagram based on degree value

圖6 核心靶點GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis of core target

2.5.2 KEGG通路富集分析 將核心靶點上傳至Metascape數據庫進行KEGG通路富集分析，得到9條差異顯著條目（P<0.05）,結果顯示，靶點主要涉及AGE-RAGE信號、癌癥蛋白聚糖通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、麻疹、膀胱癌、Th17細胞分化通路、小細胞肺癌、白細胞跨內皮遷移及自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路（圖7）。根據通路-靶點網絡圖可知，AGE-RAGE信號通路、癌癥蛋白聚糖通路、血流剪切應力與動脈粥樣硬化通路及Th17細胞分化通路涉及基因數較多（圖8）。

圖7 核心靶點KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of core target

圖8 KEGG通路富集分析基因通路-靶點網絡圖Fig.8 KEGG pathway enrichment analysis gene pathway-target network diagram

3 討 論

奶牛子宮腔平時處于封閉狀態，一般情況下沒有外界病原微生物侵入，但在奶牛妊娠期間，尤其是分娩前后，子宮頸口開張，并持續排出惡露，此狀態一直持續21 d左右，在此期間奶牛發生子宮內膜炎的風險提高，通常為細菌侵襲感染，細菌內毒素脂多糖通過與子宮內膜上皮Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4,TLR4）結合，激活NF-κB信號通路，使p65和IκBα的磷酸化水平升高[14]，造成子宮內膜炎。感染后細菌毒素及炎性物質會影響卵泡發育和黃體的生成，從而對卵巢功能造成損害，使排卵期延后甚至停止[15]。中藥復方中的丹參、黃芩等藥物可抑制NF-κB的核移位及調控該通路的活化，降低p65和IκBα的磷酸化水平，有效頡頏脂多糖誘導的細胞炎癥[16]。 證明該中藥復方對奶牛子宮內膜炎引起的炎癥癥狀具有緩解作用，從而達到治療的作用。

通過網絡藥理學對中藥復方藥物成分進行解析，其中槲皮素、山奈酚、黃芩素、丹參酮ⅡA為主要作用成分。槲皮素與山奈酚大量存在于多種中藥中，屬于黃酮類化合物，是起治療作用的主要成分之一，有抗菌、消炎、抗氧化等作用[17-18]。黃芩素為黃芩中的主要活性成分，經體外試驗結果證明，其抑菌效果較為顯著，對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌均有良好的抑菌作用[19]，丹參酮ⅡA大量存在于丹參中，具有抗炎、抗氧化作用，同時還對冠心病、腦血管疾病和心血管疾病具有改善作用[20]，該物質可通過Nrf2通路對高血壓疾病進行自發性的緩解[21]，對炎癥反應中造成的局部血壓升高有良好的治療作用。Fu等[22]報道，丹參酮ⅡA抑制環氧化酶-2和誘導型一氧化氮合酶（iNOS）的基因表達，降低脂多糖誘導的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的表達。此外，丹參酮ⅡA抑制丙二醛水平，但可提高過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性，通過試驗證明，丹參酮ⅡA通過激活Nrf2信號通路表現出抗炎和抗氧化作用。本研究結果與以上結果基本一致，說明該中藥復方的藥物活性成分具有抗菌消炎等作用，從而達到治療奶牛子宮內膜炎的目的。

這些中藥活性成分主要作用于TNF、AKT1、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等關鍵靶點蛋白。奶牛患有子宮內膜炎時TNF、IL-1β與IL-6表達水平均顯著升高[23]，IL-1β與IL-6等促炎因子可通過自身影響細胞組織，使炎癥的級聯反應放大，引起巨噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞、T細胞、B細胞等免疫細胞在炎癥局部聚集，并釋放炎癥介質，加速炎癥作用的發生[24]，CXCL8可促進炎癥反應的發生，在與中性粒細胞接觸后，會使中性粒細胞游走至作用部位，并釋放可引發局部炎癥反應的活性物質，同時發揮殺菌和損傷細胞的作用[25]；AKT1與TP53均參與細胞凋亡與葡萄糖代謝作用，影響細胞的增殖和生長。PTGS2可通過抑制環氧活酶（COX）活性來減少前列腺素的產生，從而減輕炎癥作用，達到消炎鎮痛的效果[26]。這些靶點蛋白均與炎癥反應的發生有密切聯系，因此本研究通過富集分析這些靶點蛋白的功能和通路來探討中藥復方治療奶牛子宮內膜炎的作用機制。

根據Metascape數據庫對該中藥復方治療奶牛子宮內膜炎的核心靶點進行KEGG通路富集分析。結果表明，癌癥蛋白聚糖、血流剪切應力與動脈粥樣硬化、麻疹、膀胱癌、Th17細胞分化通路、小細胞肺癌、白細胞跨內皮遷移及自然殺傷細胞介導的細胞毒性通路是該病的主要作用通路。AGE是在體內脂肪和糖類極高的環境下形成具有一定毒性的大分子化合物，與RAGE結合形成通路。通常該通路的發生與糖尿病等代謝機能障礙性疾病相關，但在該通路的作用下，組織活性氧自由基大量生成，使機體的抗氧化機制受到影響，多種細胞因子的釋放，造成了炎癥反應的發生，且AGE激活NF-κB通路的傳導[27]，使p65與IκBα磷酸化，導致子宮內膜炎的發生，而丹參的單體成分可通抑制NF-κB通路的激活，減輕炎癥反應[28]。大腸埃希菌感染子宮內膜后，內膜上皮組織分泌IL-1β、IL-6、TNF-α[29]等炎性因子對炎癥起到了促進的作用，而IL-6的分泌與Th17細胞的分化有直接關系[30]，黃芩苷為該中藥復方的主要成分之一，吳峰淼等[31]研究結果表明,黃芩苷改變對Th17與Treg細胞的免疫平衡，使JAK/STAT3的激活受到抑制，以減輕炎癥反應。

4 結 論

由丹參、益母草、連翹及黃芩組成得中藥復方治療奶牛子宮內膜炎可能是通過槲皮素、山奈酚、黃芩素、丹參酮ⅡA等藥物活性成分，作用于TNF、AKT1、PTGS2、CXCL8、TP53、IL-1β、IL-6等核心靶點，通過AGE-RAGE信號通路及Th17細胞的分化對奶牛子宮內膜炎產生治療作用。該中藥復方藥物的治療作用仍需進一步試驗驗證，本研究結果為今后的動物試驗及相關臨床研究提供了依據和參考。