CDK5在魚藤酮誘導的多巴胺能神經元凋亡中的作用

黃 杰 張振濤 陳春暖 王洪財 熊 婧 王 濤

帕金森病 （Parkinson’s Disease，PD）是一種常見的神經系統變性疾病，其病因和發病機制至今尚未闡明。有研究表明細胞周期調節因子的表達異常所引發的神經元凋亡是許多神經變性疾病的發病機制之一［1］。細胞周期素依賴性蛋白激酶5（cyclin－dependent kinase5，CDK5）是一種主要在神經元內表達的細胞周期分子，參與神經系統發育過程，而且與許多神經退行性疾病的發病相關［2］。有研究發現CDK5參與阿爾茨海默病的神經變性過程，且PD患者剖檢標本中CDK5表達也有增高［3］，但其是否參與PD發病尚未見報道。本研究采用多巴胺能細胞系SH－SY5Y細胞，利用魚藤酮毒素建立PD細胞模型來研究CDK5在PD神經元損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗細胞 人神經母細胞瘤細胞系（SHSY5 Y）由華中科技大學同濟醫學院藥理學系提供。

1.1.2 實驗試劑 DMEM F12培養基購自Gibco公司，胎牛血清購Gibco自公司。四甲基氮唑鹽（MTT）、魚藤酮、Annexin－V／PI凋亡試劑檢測盒、藥品Olomoucine、MDL28170均購于Sigma公司，兔抗人CDK5、p35／25抗體購自Santa Cruz公司，其余試劑均為國產分析純。

1.2 細胞培養 SH－SY5Y置于DMEM F12培養基中，內含10%（體積分數）滅活胎牛血清、青霉素100U／L、鏈霉素100U／L，于5%（體積分數）CO2、37℃培養箱內進行培養，隔天換液。

1.3 MTT法檢測細胞活力 調節SH－SY5Y細胞密度約2×105／m L，以100μL／孔接種于96孔板，分別加入不同濃度的魚藤酮處理24 h，每種處理5個復孔，每孔加入5 mg／m L MTT10μL，繼續培養4h；棄培養基，每孔加二甲基亞砜100μL，37℃孵育20 min，至顆粒溶解，在酶標儀上測定570 nm的吸光度［OD］值，將OD值作為反映SH－SY5Y細胞活性和代謝狀況的參數；細胞存活率＝試驗組OD570 n M值／對照組OD570 n M值×100%。

1.4 細胞分組及藥物處理

細胞傳代培養至5 m L培養瓶中，待細胞長滿70%～80%后給予藥物處理。魚藤酮、Olomoucine、MDL28170均用DMSO溶解，使DMSO在細胞培養液中的終濃度小于0.4%。實驗分四組：A組為溶劑空白對照組；B組為單純10μmol／L魚藤酮組；C組為30μmol／L MDL28170＋10μmol／L魚藤酮組；D 組這100μmol／L Olomoucine＋10 μmol／L魚藤酮組（Olomoucine、MDL28170預處理細胞2 h后再加入魚藤酮）。以上四組細胞將分別在藥物處理24 h和48 h兩個時間點進行流式細胞術檢測凋亡以及采用 Western－blot法檢測相關蛋白的表達。

1.5 磷脂結合蛋白（Annexin－V）－碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染色檢測細胞凋亡經藥物處理后于指定的時間點收獲細胞，用不含EDTA的胰酶消化各組SH－SY5Y細胞，離心1200 r／min，制成單細胞懸液，調整細胞密度為5×105／ml，取100μl細胞懸液，加入buffer緩沖液使反應體系至400μl，分別加入5μl Annexin－V／FITC和10μl PI溶液，混勻后室溫避光孵育15 min。通過流式細胞儀（美國BD公司）檢測凋亡。

1.6 免疫印跡法（Western blot）檢測不同組細胞CDK5、p35、p25的蛋白表達水平 取處理足夠時間的不同實驗組細胞，吸棄培養液，加入適當裂解液裂解細胞，將細胞從培養瓶刮下，混勻，1200 r／min離心5 min，吸上清液，用Brandford法檢測蛋白濃度后加入上樣緩沖液煮沸5 min，取適量樣品進行SDS－PAGE電泳分離，分離的蛋白用濕法電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；分別用兔抗人CDK5、p35／25一抗4℃孵育膜過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育2 h，化學發光法顯色，顯影及曝光；同時以β－actin作為內參；實驗重復三次。

1.7 統計學處理

應用SPSS 10.0統計軟件，實驗數據采用均數±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析（ANOVA），組間比較采用Tukey’s檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 魚藤酮對細胞活力及代謝的影響

經魚藤酮處理細胞24 h后細胞活力發生了變化，細胞活力呈量效依賴性降低（圖1）。經0.5、1、2、5、10、50、100μmol／L魚藤酮處理24 h后細胞活力分別下降至對照組的（86.84±1.61）%、（72.36±6.22）%、（65.31±4.27）%、（65.06±3.73）%、（55.75±0.80）%、（26.61±0.59）% 和 （19.21±1.83）%（P＜0.01）。

圖1 不同濃度魚藤酮作用24 h后對細胞活力的影響與對照組比較，＊P＜0.01

2.2 魚藤酮及CDK5抑制劑對細胞凋亡的影響

B組在24 h及48 h時間點的細胞凋亡率明顯高于A組 （表1）。采用兩種不同CDK5阻滯劑MDL28170和Olomoucine預處理細胞，細胞凋亡率與B組相比有明顯下降。（24 h con vs rot q＝13.76 rot vs mdl q＝7.661 rot vs olo q＝10.13；48 h con vs rot q＝14.0 rot vs mdl q＝6.852 rot vsolo q＝7.764以上P均＜0.05）。

表1 各組的細胞凋亡率百分比的比較

2.3 各組細胞形態學改變

A組細胞突起明顯，細胞透明，形態多樣。魚藤酮作用24 h后細胞突起明顯減少皺縮，細胞變圓，胞體內顆粒物增多，魚藤酮處理48 h后兩者對比更加顯著，并且在24、48 h兩個時間點 MDL28170預處理組、Olomoucine預處理組的細胞形態學改變介于A組與B組之間（圖2 A－H）。

圖2 各組細胞形態學變化（×400倍）

2.4 各組細胞CDK5、p25／p35表達水平

在魚藤酮處理24 h后細胞內CDK5的表達較對照組明顯增加（圖3，A組vs B組，P＜0.05），而MDL28170和Olomoucine處理后的細胞CDK5的表達則不同程度的低于B組（圖2，B組vs C組、D組P＜0.05），在藥物作用48 h時間點魚藤酮組CDK5表達更高，但藥物處理組仍然能看到CDK5的活性被抑制（24 h con vs rot q＝25.35；rot vs mdl q＝12.31；rot vs olo q＝11.36；48 h con vs rot q＝27.45；rot vs mdl q＝9.259；rot vs olo q＝9.198以上P均＜0.05）

圖3 各組及不同時間點的CDK5表達水平（以CDK5的相對OD值的平均數來表示） 與A組比較，＊P＜0.05；與各組比較，△P＜0.05；與C組比較，▲P＜0.05

魚藤酮處理細胞24 h后細胞內表達p25／p35的比值增加，明顯高于A組，而MDL28170（一種鈣調蛋白激酶抑制劑）通過抑制p35向p25的轉化，使p25／p35比值低于B組。48 h時MDL組仍能看到對p35向p25的轉化抑制。24和48h時間點Olomoucine也能降低p35→p25的轉換（24 h con vs rot q＝36.06 rot vs mdl q＝40.36 rot vs olo q＝19.52；48 h con vs rot q＝82.07 rot vs mdl q＝42.81 rot vs olo q＝46.12以上P 均＜0.05）（圖4）。

圖4 各組在不同時間點的p25／p35表達比 與A組比較，＊P＜0.05；與B組比較，△P＜0.05；與C組比較，▲P＜0.05

3 討 論

CDK5是一種脯氨酸限定的絲／蘇氨酸蛋白激酶，是細胞周期依賴性蛋白激酶家族中的一員。但其并不直接參與細胞周期的調節。CDK5主要通過對其眾多底物的磷酸化來參與神經元生物活性的調節。研究顯示CDK5在神經發育過程中起著關鍵作用，它通過調節在輻射遷移過程中神經元與膠質細胞的相互作用，使皮質分層結構最終形成。CDK5還參與神經元分化和軸突的形成，并且在細胞運動和粘附，突觸可塑性，藥癮形成，以及神經退行性疾病中都扮演著重要角色［2］。

由于CDK5的主要激活物p35／p25主要在神經系統表達，所以其在神經系統疾病研究中被廣泛重視。在PD患者剖檢標本中的黑質、藍斑和新皮質的路易體中能檢測到CDK5和p35［3］。此外在剖檢的PD患者扣帶回腦組織中還發現，p25／p35蛋白的比例增加［4］。這些都提示CDK5與PD發病機制密切相關。

通常認為CDK5主要被p35和p25活化。在病理狀態下，p35被激活的鈣調蛋白激酶（μ－calpain）水解為p25，而p25較p35難于水解，所以CDK5與p25結合后就使CDK5過度活化，過度激活的CDK5激發下游分子而引發一系列改變［5］。Smith等通過在MPTP誘導的大鼠PD模型研究中發現，MPTP誘導p25的表達增加，進而使CDK5／p25復合物過度活化，最終誘發神經元凋亡［6］。本研究首先采用魚藤酮處理SHSY－5Y細胞來復制PD細胞模型。本實驗表明，經魚藤酮處理后細胞內CDK5的表達、p25／p35的比值較未用魚藤酮處理組上升，而魚藤酮能明顯誘發細胞凋亡，結合前人研究結果，本研究推測CDK5與細胞凋亡相關。然后，本研究通過鈣調蛋白激酶的抑制劑MDL28170來預處理細胞，發現MDL28170能抑制p35水解為p25，從而降低CDK5的活化表達，來保護魚藤酮毒素誘發的細胞凋亡。同時我們利用CDK5的阻滯劑Olomoucine來直接干預細胞，通過降低CDK5的活性而對抗凋亡。有趣的是Olomoucine并不具有抑制鈣調蛋白激酶的作用，本研究推斷，由于CDK5活性被Olomoucine抑制，使CDK5自身磷酸化p35來促進p35降解的過程被減弱［7］，所以實驗中我們觀測到Olomoucine也能一定程度抑制p25／p35的比值上升。

CDK5促進神經元凋亡的機制目前尚不明確。有研究顯示，MEF－2（肌細胞促進因子2）是一個抗凋亡的轉錄因子，能被p38、MAPK、ERK5磷酸化而激活。CDK5通過444位點的絲氨酸磷酸化MEF－2后，阻止了 MEF－2的拮抗凋亡作用而促進凋亡［8］。Kim等認為p25／CDK5的活化能夠抑制組蛋白去乙酰化酶 （histone deacetylase，HDAC1）的活性，從而使細胞周期相關基因表達細胞周期異常重啟，DNA雙鏈斷裂，從而誘發細胞凋亡［9］。在魚藤酮誘導多巴胺能神經元凋亡的過程中是否引發上述過程，值得我們進一步深入研究。

總之，本研究結果表明，CDK5在魚藤酮誘導多巴胺能神經元凋亡的過程發揮著重要作用，通過直接抑制CDK5的表達，或通過抑制p35水解為p25來降低CDK5的活化都能在魚藤酮PD細胞模型中發揮對抗凋亡的保護作用。

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2 Shirley BS，Gail VW.Cyclin－dependent kinase 5 in neurodegeneration.Neurochem，2004，88（6）：1313－1326.

3 Nakamura S，Kawamoto Y，Nakano S，et al.p35nck5a and cyclin－dependent kinase 5 colocalize in Lewy bodies of brains with Parkinson＇s disease.Acta Neuropathol（Berl.），1997，94（2）：153－157.

4 Daniel Alvira，Isidre Ferrer，Javier GC，et al.Activation of the calpain／cdk5／p25 pathway in the girus cinguli in Parkinson＇s disease.Parkinsonism and Related Disorders，2008，14（4）：309－313.

5 Patrick GN，Zukerberg L，Nikolic M，et al Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration.Nature，1999，402（6762）：615－622.

6 Smith PD，Crocker SJ，Jackson LV，et al.Cyclin－dependent kinase 5 is a mediator of dopaminer－gic neuron loss in a mouse model of Parkinson＇s disease.Proc Natl Acad Sci，2003，100（23）：13650－13655.

7 Patrick GN，Zhou P，Kwon YT，et al.The neuronal－speci？c activator of CDK5 is degr－raded by the ubiquitin－proteasome pathway.Biol Chem，1998，273（37）：24057－24064.

8 Smith PD，Mount MP，Shree R，et al.Calpain－regulated p35／cdk5 plays a central role in dopaminergic neuron death through modulation of the transcription factor myocyte enhancer factor 2.Neurosci，2006，26（2）：440－447.

9 Kim D，Frank CL，Dobbin MM，et al.Deregulation of HDAC1 by p25／Cdk5 in Neurotoxicity.Neuron，2008，60（5）：803－817.