大果木姜子主要揮發(fā)性成分防治冠心病的分子機制研究

陳思宇　唐子茜　楊欣　涂小華　袁龍飛　潘思佳　鄧萬娟　趙廷廷

【摘 要】 目的：采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析大果木姜子主要揮發(fā)性成分治療冠心病的分子機制。方法：通過頂空固相微萃取技術(shù)分析貴州大果木姜子揮發(fā)性成分，統(tǒng)計相對含量大于5%揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點篩選，通過Swiss Target Prediction對主要揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點篩選，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“Coronary heart disease ”為關(guān)鍵詞檢索冠心病疾病靶點，基于R 中clusterProfiler包進(jìn)行GO（Gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ）富集分析，通過STRING數(shù)據(jù)庫檢索靶點可能的潛在相互作用。結(jié)果：檜烯（15.54%）、桉樹油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）相對含量大于5%，共篩選出126個靶點，基于GeneCards篩選出冠心病靶點1709個，通過FunRich取交集，篩選出大果木姜子治療冠心病靶點66個，主要通過PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）防治冠心病。通過蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)alpha-2A腎上腺素能受體（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）、過氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）為關(guān)鍵靶點。結(jié)論：大果木姜子主要揮發(fā)性成分防治冠心病的關(guān)鍵靶點為ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C、PPAR-γ。

【關(guān)鍵詞】 大果木姜子;冠心病;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);通路分析

【中圖分類號】R285.5【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號】1007-8517（2022）05-0033-06

基金項目：貴州中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項目[貴中醫(yī)大創(chuàng)合字（2018）8號];貴州中醫(yī)藥大學(xué)科研項目[貴中醫(yī)科院內(nèi)（2019）21號]。

作者簡介：陳思宇（1999-），女，漢族，本科，研究方向為中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。E-mail：1208877346@qq.com

通信作者：楊欣（1987-），女，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail：25066640 @qq.com

Study on the Molecular Mechanism of Main Volatile Components of Litsea lancilimba Merr.

in the Control of Coronary Heart Disease

CHEN Siyu TANG Zixi YANG Xin* TU Xiaohua YUAN Longfei PAN Sijia DENG Wanjuan ZHAO Tingting

Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025，China

Abstract：Objective Using network pharmacology to analyze the molecular mechanism of the main volatile components of Litsea lancilimba Merr. in the treatment of coronary heart disease. Methods Analysis of volatile components of Litsea lancilimba Merr. by headspace solid phase microextraction technology， the relative content of volatile components were more than 5%， and the main volatile components were selected by Swiss Target Prediction. Search for coronary heart disease target with “Coronary heart disease” as key word in GeneCards database. Based on the clusterProfiler package in R for GO（Gene ontology） and KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes ） enrichment analysis. Retrieving possible potential interactions of targets through STRING databases. Results The relative contents of sabinene（15.54%）， eucalyptus oil（6.50%） and β-bamboos（10.04%）were more than 5%. A total of 126 targets were screened. 1709 coronary heart disease targets selected based on GeneCards. 66 targets for the treatment of coronary heart disease in Litsea lancilimba Merr. were selected by FunRich. Prevention and treatment of coronary heart disease mainly through PPAR signaling pathway.Protein interaction analysis revealed alpha-2A adrenergic receptor（ADRA2A）， alpha-2B adrenergic receptor（ADRA2B）， Alpha-2C adrenergic receptor（ADRA2C） and Peroxisome proliferator-activated receptor gamma（PPAR-γ） are key targets. Conclusion The key targets of the main volatile constituents of the major volatile components in the prevention and treatment of coronary heart disease are ADRA2A， ADRA2B， ADRA2C and PPAR-γ.1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

Key words：Litsea lancilimba Merr.; Coronary Heart Disease; Network Pharmacology; Pathway Analysis

冠心病全稱冠狀動脈性心臟病（Coronary heart disease，CHD），為臨床常見疾病之一，嚴(yán)重威脅人類健康，其發(fā)病率和死亡率逐年上升。目前，從抗凝降脂、抗血小板、減弱心肌收縮力、擴冠脈等對癥治療，治療效果顯著，且起效快，但是不良反應(yīng)也會導(dǎo)致心肌梗死危及生命^[1]。CHD是一種高危害性的心臟疾病，不做好預(yù)防會導(dǎo)致惡變。CHD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)危險因素、發(fā)病機制成為研究的熱點。目前在臨床上應(yīng)用中藥、針灸等中醫(yī)療法結(jié)合歷代醫(yī)家的理論與臨床經(jīng)驗，在冠心病的治療上發(fā)揮了較大的優(yōu)勢^[2]。

大果木姜子（Litsea lancilimba Merr.）是貴州苗族 、布依族民間習(xí)用藥材，稱為貴州十大苗藥之一。具有溫中散寒、理氣止痛，是苗族治療心痛、胸痹、腹痛的常用草藥，藥理學(xué)研究^[3]發(fā)現(xiàn)其在冠心病、心絞痛等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。實驗^[4]證明大果木姜子揮發(fā)油含量較高，其化學(xué)成分主要為單萜或倍半萜類，未發(fā)現(xiàn)對人體有害的黃樟醚等物質(zhì)。因此，本研究通過前期實驗獲得大果木姜子揮發(fā)油的主要化學(xué)成分，對主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，獲得主要化學(xué)成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選出大果木姜子主要化學(xué)成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點。

1 實驗材料及方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件 GeneCards（https：//www.gen ecards.org/）;Cytoscape 3.5.1 （http：//www. cytoscape.org）;STRING（https：//string-db.org/）;R（https：//www.r-project.org）;Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）。

1.2 貴州大果木姜子主要揮發(fā)性化學(xué)成分靶點篩選 通過頂空固相微萃取技術(shù)（Headspace solid phase microextraction，HS-SPME）分析貴州大果木姜子揮發(fā)性成分，統(tǒng)計相對含量大于5%揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點篩選，通過Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）對主要揮發(fā)性成分進(jìn)行靶點篩選，選擇“人源”篩選其調(diào)節(jié)的靶點。

1.3 疾病靶點分析 GeneCards（https：//www. genecards.org/）數(shù)據(jù)庫作為檢索人類基因信息的最優(yōu)解，整合了眾多文獻(xiàn)信息，覆蓋了多個數(shù)據(jù)庫對于基因的分析數(shù)據(jù)。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫中以“Coronary heart disease ”為關(guān)鍵詞搜索冠心病靶點。

1.4 GO及通路富集分析 基于R 中clusterProfiler包進(jìn)行GO分析，包括細(xì)胞組成（Cellular Component）、生物過程（Biological Process）和分子功能（Molecular Function）。clusterProfiler同時支持GO和KEGG的富集分析。根據(jù)靶點id進(jìn)行富集分析，選擇p-value<0.05為閾值。

1.5 關(guān)鍵靶點分析 通過STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）檢索了編碼蛋白間可能的潛在相互作用，并構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，打開STRING數(shù)據(jù)庫點擊“SEARCH”模塊。選擇“Multiple proteins”輸入篩選出的基因或蛋白名稱，并在“Organism”中指定物種。下載STRING數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)^[5]。

3 實驗結(jié)果

3.1 主要揮發(fā)性成分治療冠心病的靶點 本實驗選擇相對含量大于5%的成分進(jìn)行研究，其中檜烯（15.54%）、桉樹油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %）為研究對象（表1）。基于Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫共篩選出126個靶點。基于GeneCards篩選出冠心病靶點1709個，通過FunRich將大果木姜子主要揮發(fā)性成分靶點與冠心病靶點取交集，共篩選出66個靶點（如圖1所示）。

3.2 GO分析

3.2.1 潛在靶點生物過程分析 對66個靶點進(jìn)行生物過程分析（表2）。在生物過程中，66個靶點主要參與類固醇激素介導(dǎo)的信號通路（Steroid hormone mediated signaling pathway）、脂質(zhì)代謝過程的調(diào)節(jié)（Regulation of lipid metabolic process）、激素介導(dǎo)的信號通路（Hormone-mediated signaling pathway）。

3.2.2 潛在靶點細(xì)胞成分分析 對66個靶點細(xì)胞成分分析（表3），66個靶點主要存在突觸前面（Presynaptic membrane）、突出后膜（Postsynaptic membrane）、突觸細(xì)胞膜（Synaptic membrane）和RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等。

3.2.3 靶點分子功能分析 對66個靶點進(jìn)行分子功能分析（表4）。在分子功能分析中發(fā)現(xiàn)，66個靶點主要具有類固醇激素受體的活性（steroid hormone receptor activity）、核受體的活性（nuclear receptor activity）、類固醇的結(jié)合（steroid binding）、核受體轉(zhuǎn)錄輔激活因子活性（nuclear receptor transcription coactivator activity）等。1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6

3.3 通路分析 對66個靶點進(jìn)行通路分析（表5）。圖2為通路分析的前10項（P-Value<0.05）。在通路分析中，66個靶點參與多條信號通路，與心血管相關(guān)的通路有PPAR信號通路（PPAR signaling pathway）、血管平滑肌收縮（Vascular smooth muscle contraction）、CGMP-PKG信號傳導(dǎo)途徑（cGMP-PKG signaling pathway）等，其中PPAR信號通路為核心通路。

3.4 關(guān)鍵靶點分析 66個靶點使用 STRING 結(jié)合R軟件進(jìn)行PPI分析，66個靶點關(guān)聯(lián)密切。根據(jù)Degree 繪制蛋白質(zhì)節(jié)點的條形圖，如圖3所示。Degree>15 的節(jié)點包括alpha-2A腎上腺素能受體（alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）過氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ），關(guān)鍵靶點的生物學(xué)效應(yīng)見表4。

4 討論

隨著人口老齡化、人口增長，心血管疾病的患病人數(shù)也逐漸增加，同時高血脂、糖尿病、高血壓等患病率的上升促使冠心病的患病人數(shù)與日俱增，不良生活方式使冠心病越來越趨于年輕化，我國心血管疾病死亡率居首位，嚴(yán)重影響人類的生活質(zhì)量和生命健康。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在冠心病治療上有一定的優(yōu)勢，其中中藥是冠心病治療方法中不可缺少的部分^[6]。大果木姜子揮發(fā)油能食用和藥用。目前，在心血管疾病方面開發(fā)了米槁心樂滴丸、心胃丹膠囊、米槁精油滴丸等。本研究發(fā)現(xiàn)大果木姜子主要揮發(fā)性成分為檜烯（15.54%）、桉樹油（6.50%）、β-石竹烯（10.04 %），相對含量大于5%，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)的靶點主要參與PPAR信號通路防治冠心病。過氧化物酶體增殖物激活型受體（Peroxisome proliferator activated-receptors， PPARs）已發(fā)現(xiàn)有PPAR-α、PPAR-β、PPAR-γ三種亞型，其中以PPAR-γ的研究較為深入，在血管壁細(xì)胞（如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞）及心肌細(xì)胞等有表達(dá)，能改善心室重構(gòu)，與心血管疾病和高血壓有關(guān)^[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)大果木姜子主要揮發(fā)性成分治療冠心病的關(guān)鍵靶點為alpha-2A腎上腺素能受體（Alpha-2A adrenergic receptor，ADRA2A）、alpha-2B腎上腺素能受體（Alpha-2B adrenergic receptor，ADRA2B）、Alpha-2C 腎上腺素能受體（Alpha-2C adrenergic receptor，ADRA2C）過氧化物異構(gòu)酶體增殖子激活受體（Peroxisome proliferator- activated receptor gamma， PPAR-γ）。其中腎上腺素能受體主要是作為媒介轉(zhuǎn)導(dǎo)為兒茶酚胺作用的組織受體。α2腎上腺素能受體分為ADRA2A、ADRA2B、ADRA2C三種亞型。已有研究^[8]表明：對腎上腺素能α、β受體進(jìn)行阻斷作用，產(chǎn)生阻斷作用可有效降低血壓、預(yù)防心律失常等疾病的發(fā)生;PPAR-γ屬于核受體家族成員，已有研究^[9]發(fā)現(xiàn)：PPAR-γ在冠心病患者血清中明顯高于健康人群，然而PPAR-γ在冠心病相關(guān)研究較少，因此明確PPAR-γ在冠心病的相關(guān)性及作用機制，具有重要的臨床意義^[9]。本研究將分析化學(xué)和計算機理論知識運用到科研上，加強學(xué)科之間的相互滲透、融合^[10-11]。篩選出大果木姜子揮發(fā)油的預(yù)防冠心病的關(guān)鍵靶點，為其揮發(fā)油藥理作用的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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（收稿日期：2021-07-12 編輯：陶希睿）1995F08F-1AD4-4998-96D6-3A1CB4DAB0B6