大黃素對慢性腎衰犬氧化應激及微炎癥狀態的影響

朱道仙 ， 劉 莉 , 趙學剛 ， 陸 江 ， 盧 煒 ， 劉 靜

(1.江蘇農牧科技職業學院動物醫學院 ， 江蘇 泰州 225300 ； 2.江蘇農牧科技職業學院寵物科技學院 ， 江蘇 泰州 225300)

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)表現為腎功能減退，代謝廢物潴溜，水、電解質和酸堿平衡失調，以及與腎臟有關的多種內分泌功能失調，以至于不能維持機體內環境的穩定而引發的臨床綜合征[1]。近年來，寵物犬的慢性腎衰竭發病率逐年上升，治療費用較高，治療效果較差，對寵物診療工作者和寵物主人均產生了嚴峻的挑戰。微炎癥狀態是指機體內存在低水平、持續性的炎癥狀態，但無炎癥表現，表現為促炎因子(如IL-1、IL-6及TNF-ɑ等)升高。大量研究發現，氧化應激損傷與微炎癥狀態是慢性腎衰竭發生發展的重要因素，并且與預后密切相關[2-3]。大黃素是中藥大黃的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。臨床試驗結果顯示，大黃素對不同動物的CRF治療效果不一，對人的CRF具有一定療效[5]，而對貓的CRF無治療價值[6]。大黃素是否可通過抑制氧化應激和微炎癥狀態改善犬的CRF未見文獻報道。因此，本試驗通過收集犬CRF臨床病例并給予大黃素進行干預治療，探討大黃素對CRF患犬氧化應激和微炎癥狀態的影響，為大黃素在犬腎臟疾病中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選取2018年1月—2019年7月于江蘇農牧科技職業學院教學寵物醫院就診的按國際腎病研究協會(IRIS)犬貓慢性腎病診斷標準[7]診斷為慢性腎衰竭的患犬47例。所有用于研究病例的主人均對本試驗計劃有詳細的了解，并簽署知情同意書。

1.2 試驗方法 按隨機數字表法將47例病例隨機分成4個治療組：常規治療組(UT組，n=8)、低劑量大黃素治療組(LRT組，n=12)、中劑量大黃素治療組(MRT組，n=12)和高劑量大黃素治療組(HRT組，n=15)；同時選擇10例健康犬作為對照組(CG組)。UT組患犬治療方案為口服復方α-酮酸片(河北天成藥業有限公司，1片/次，2 次/d)+自由采食腎臟處方糧(上海信元動物藥品有限公司生產)；LRT組、MRT組和HRT組分別在UT組治療基礎上按25、50 mg/(kg·bw·d)和100 mg/(kg·bw·d)口服大黃素(西安嘉和生物技術有限公司，大黃素含量≥98%)。治療期間所有動物自由飲食，試驗期15 d。

1.3 樣本采集與指標測定 治療前和治療后，空腹采集血液用ELISA法檢測血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平；化學比色法測定血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和總抗氧化能力(T-AOC)；ELISA檢測血清炎癥因子C-反應蛋白(CRP)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。同時采集尿液用ELISA檢測尿8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-dG)、肌酐(Cr)和尿腎臟損傷因子-1(KIM-1)含量。尿中8-OH-dG濃度的最終數值采用Cr值較正，單位為ng/mg Cr。

1.4 數據處理 結果用“平均值±標準差”表示,采用SPSS 22.0統計軟件ANOVA程序單因素方差分析進行組間比較，治療前后比較采用配對t檢驗分析，分類資料用卡方檢測，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。各檢測指標的變化幅度=(治療后水平-治療前水平)/治療前水平×100%。

2 結果

2.1 大黃素對CRF患犬腎功能的影響 結果如圖1所示，各治療組的Scr、BUN和KIM-1水平治療后均低于治療前(P<0.05)。治療后比較，HRT組Scr水平低于MRT組、LRT組和UT組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組≥LRT組≥UT組(圖1A)；HRT組BUN水平低于其他3個治療組(P<0.05)， MRT組BUN低于LRT組和UT組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組>LRT組≥UT組(圖1B)；HRT組KIM-1水平低于其他3個治療組(P<0.05)，降低幅度依次為HRT組>MTR組≥LRT組>UT組(圖1C)。

圖1 各組犬腎功能指標的變化

2.2 大黃素對CRF患犬氧化應激水平的影響 治療后的結果如表1所示，與UT組比較，HRT組血清MDA和尿液8-OH-dG水平均顯著降低(P<0.05)，血清SOD和T-AOC水平均顯著升高(P<0.05)，LRT組和MRT組僅MDA水平顯著降低(P<0.05)，但各治療組的MDA、SOD、T-AOC和8-OH-dG水平均與CG組存在顯著差異(P<0.05)。經過治療，HRT組的MDA和8-OH-dG水平比治療前分別降低了38.6% 和17.2%，SOD和T-AOC水平比治療前分別升高了19.3%和18.6%，與其他治療組有統計學差異(P<0.05，圖2A)。

表1 治療后各組氧化應激水平的比較

2.3 大黃素對CRF患犬血清炎癥因子水平的影響 治療后的結果如表2所示，HRT組的CRP水平顯著低于LRT組和UT組，IL-6、TNF-α水平顯著低于MRT組、LRT組和UT組(P<0.05)；MRT組CRP、IL-6和TNF-α水平均低于UT組(P<0.05)；但各治療組CRP、IL-6和TNF-α水平均顯著高于CG組(P<0.05)。 經過治療，HRT組的CRP、IL-6和TNF-α水平較治療前分別降低了40.5%、47.1%和48.2%，與其他治療組均有顯著差異(P<0.05，圖2B)。

圖2 各治療組治療后氧化應激與炎癥因子水平的變化程度

表2 治療后各組血清炎癥因子的變化

2.4 腎功能指標與氧化應激及炎癥因子的相關性分析 通過Pearson分析腎功能指標與氧化應激及炎癥因子指標的相關性，結果發現：Scr、BUN和KIM-1等腎功能指標均與MDA、CRP、IL-6、TNF-α和8-OH-dG呈正相關關系，Scr、KIM-1與SOD呈負相關關系,BUN與SOD、T-AOC均呈負相關關系(圖3)。

圖3 腎功能指標與氧化應激及炎癥因子相關性熱圖

3 討論

Scr和BUN分別為肌肉組織代謝終產物和蛋白質代謝產物，由腎小球濾過而排出體外，當患者腎功能不全時，血清中兩者含量將會升高，因此檢測血清中Scr和BUN的含量即可反映腎小球濾過功能[8-9]。KIM-1是腎臟近曲小管上皮細胞的一種跨膜糖蛋白，在正常肝、脾、腎等組織微量表達，而在受損后的近曲小管上皮細胞中表達增強，是腎小管損傷的重要標志物[10]。通過相關性分析發現，腎損傷指標Scr、BUN和KIM-1與氧化應激指標MDA、微炎癥指標CRP、IL-6和TNF-α等呈正相關，提示犬慢性腎衰的發生發展可能與氧化應激和微炎癥狀態有關。

氧化應激是機體在遭受各種有害刺激后，體內氧化和抗氧化之間的平衡被破壞，引起過多的氧化產物釋放，導致組織損傷。近年來研究人員發現，氧化應激對于腎衰竭的發生發展具有促進作用，且隨著腎功能損傷嚴重程度的增加，機體內氧化應激程度亦增強[11]。SOD、T-AOC對氧化應激起到防御作用，MDA是體內脂質過氧化作用的中間產物，這些指標變化反映了機體的氧化應激水平[12-13]。研究表明，慢性腎衰竭可導致機體抗氧化酶SOD和GSH-Px活性降低且MDA含量增加，從而發生氧化應激反應，導致細胞功能受損[14]。本試驗發現，大黃素可以增加SOD和T-AOC活性，降低MDA含量，改善CRF犬的氧化應激水平。

微炎癥狀態指以單核-巨噬細胞系統激活為中心的慢性、持繼性炎癥發應，主要以CRP、IL-1、IL-6、TNF-α等炎癥因子的高表達為表現，而無明顯臨床癥狀[15]。腎衰時腎臟功能下降，不能很好地清除炎性因子是引起微炎癥狀態的一個重要因素，而微炎癥狀態可進一步加劇腎衰的發展。有研究表明，CRP升高程度與炎癥的范圍或活力呈正相關[16]，IL-6可致腎小球系膜細胞增殖、硬化，加重腎臟疾病[17]，TNF-α在慢性腎衰竭發生發展過程中也發揮重要作用[18]。改善腎衰患犬微炎癥狀態,對提高其腎功能及生存率具有重要意義。本試驗結果顯示，大黃素可以顯著降低血液中CRP、IL-6和TNF-α水平，減輕CRF的微炎癥狀態。

在給予大黃素治療后，CRF患犬血清Scr、BUN和尿液KIM-1水平降低，且呈量效關系，說明大黃素可以提高CRF患犬的腎功能，這可能與大黃素抑制機體氧化應激和微炎癥狀態有關，具體機制還有待進一步研究。