牛源致腦炎大腸桿菌FimD、PilN蛋白的生物信息學分析和優勢B細胞表位預測

海永慧 ， 欽 倩 ， 李蓓蓓 ， 任靜靜 ， 馬 勛 ， 蔣建軍 ， 王鵬雁

(石河子大學動物科技學院 ， 新疆 石河子 832003)

腸外致病性大腸桿菌(Extra-intestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)可通過其特有的毒力因子定殖腸道外的其他組織中，最終導致宿主發病[1]。ExPEC包括新生兒腦膜炎大腸桿菌(Neonatal meningitis causingEscherichiacoli，NMEC)、尿道致病性大腸桿菌(UropathogenicEscherichiacoli，UPEC)、敗血癥大腸桿菌(SepticemicEscherichiacoli,SEPEC)[2]和禽致病性大腸桿菌(Avian pathogenicEscherichiacoli,APEC)[3]。近年來，新疆多個規?；膛ｐB殖場的犢牛出現了以神經癥狀為主的病例，剖檢發現患牛腦膜嚴重出血，從腦組織中分離出來的病原菌經鑒定為腸外致病性大腸桿菌，這給奶牛養殖場帶來了經濟損失，同時也給牛源ExPEC的防控帶來了挑戰[4]。

目前用于ExPEC的疫苗主要以傳統滅活苗為主，但此類疫苗免疫保護效果相對比較局限，且副作用大，此外，可用于牛源致腦炎大腸桿菌的疫苗鮮有報道。多表位候選疫苗可克服傳統疫苗的缺點，能更高效地刺激機體產生特異性免疫應答，并消除針對不良表位的免疫應答[5]。多表位疫苗可以刺激機體保守和有利的表位，產生免疫反應，具有更高安全性，還可以通過抗原表位的工程設計和預測來提高疫苗的廣度和效力[6]。

牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織中，本課題組前期已對其進行全基因組測序并將E.coliS9922全基因組序列分別與GenBank上公布的56個具有全基因組序列的大腸桿菌進行比較分析，得到了69個E.coliS9922特有毒力基因，因此本試驗從中選取了與黏附有關的FimD和PilN兩個菌毛蛋白，利用生物信息學工具分析其蛋白理化性質、結構和優勢B細胞表位，為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料 牛源致腦炎大腸桿菌S9922分離自新疆某奶牛場患病犢牛腦組織中，并已被鑒定為腸外致病性大腸桿菌，由石河子大學動物科技學院微生物與免疫學實驗室保存。將S9922進行全基因組測序并進行比較基因組學研究，篩選到與細菌致病有關的特異性黏附蛋白FimD、PilN等。

1.2 方法

1.2.1 蛋白的理化性質分析 運用在線服務器ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)，分析FimD、PilN蛋白的氨基酸組成、分子質量、理論等電點、原子組成、不穩定指數和平均親水系數等理化性質。

1.2.2 蛋白跨膜區、信號肽、糖基化位點和磷酸化位點分析 運用在線服務器TMHMM server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)、SignalP-5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NetNGlyc1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)，分別分析FimD、PilN蛋白氨基酸序列的跨膜區、信號肽區域、糖基化位點和磷酸化位點。

1.2.3 蛋白二級結構分析 利用SOMPA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白的β轉角、β折疊、α螺旋、無規則卷曲等結構。同時用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性較好的肽段。

1.2.4 蛋白三級結構分析 將FimD、PilN蛋白的氨基酸序列提交至在線服務器SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)，FimD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，構建FimD、PilN蛋白的三級結構模型。

1.2.5 蛋白優勢B細胞表位預測 利用BepiPred(http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)、Immunomedicine Group(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)對FimD、PilN蛋白的B細胞表位進行預測。綜合DNASTAR軟件中的Protean板塊的抗原性、柔韌性、親水性和表面可及性以及信號肽、跨膜區、二級結構，預測FimD、PilN蛋白的B細胞優勢抗原表位。

2 結果

2.1 FimD、PilN蛋白的理化性質分析 FimD蛋白由382個氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Gly占10.7%，共有41個；Ser占10.2%，共有39個；Asn占9.4%，共有36個；Thr占8.1%，共有31個；Leu占7.1%，共有27個；帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數為28，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數為25，理論等電點為6.16。FimD蛋白的原子組成為C1828H2798N510O588S9，相對分子質量為41 615.93 Da，不穩定系數為28.31，小于閾值40，歸類為穩定蛋白。平均親水系數(GRAVY)為-0.435，GRAVY的范圍為-2～2，負值表明蛋白為親水蛋白，FimD蛋白歸類為親水蛋白。

PilN蛋白由560個氨基酸組成，其中含量較多的氨基酸：Thr占12.7%，共有71個；Ser占11.1%，共有62個；Leu占9.1%，共有51個；Ala占7.7%，共有43個；Gly占7.5%，共有42個；帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數為43，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數為44，理論等電點為7.61。PilN蛋白的原子組成為C2586H4184N724O858S22。相對分子質量為59 851.32 Da，不穩定系數為36.5，小于閾值40，歸類為穩定蛋白。GRAVY為-0.274，GRAVY的范圍為-2～2，負值表明蛋白為親水蛋白，FimD蛋白歸類為親水蛋白。

2.2 FimD、PilN蛋白的跨膜區、信號肽、糖基化位點和磷酸化位點分析 利用在線服務器TMHMM分析FimD蛋白和PilN蛋白的跨膜區，結果如圖1所示，FimD蛋白不存在跨膜區，PilN蛋白在1～50位氨基酸上可能出現跨膜區。利用在線服務器SignalP-5.0 分析FimD蛋白和PilN蛋白的信號肽，結果如圖2所示，FimD蛋白不存在信號肽；PilN蛋白在26～27位氨基酸上出現信號肽。

圖2 蛋白信號肽分析

利用在線服務器NetNGlyc1.0進行蛋白糖基化位點分析，FimD蛋白共有7個潛在的糖基化位點，PilN蛋白共有2個潛在的糖基化位點。利用在線服務器NetPhos 3.1進行蛋白磷酸化位點分析，分析結果如彩版封二圖3所示，FimD蛋白共有潛在的48個磷酸化位點，其中有23個Ser位點，15個Thr位點，10個 Tyr位點；PilN蛋白共有85個潛在的磷酸化位點，其中有47個Ser位點，33個Thr位點，5個Tyr位點。

圖3 磷酸化位點分析

2.3 FimD、PilN蛋白的二級結構分析 利用在線服務器SOPMA對蛋白的二級結構進行分析，FimD蛋白結果如彩版封二圖4所示，α螺旋占6.54%，延伸鏈占32.94%，β轉角占5.50%，無規則卷曲占56.02%；PilN蛋白結果如彩版封三圖5所示，α螺旋占23.75%，延伸鏈占20.54%，β轉角占4.29%，無規則卷曲占51.43%。

圖4 FimD蛋白二級結構預測

圖5 PilN蛋白二級結構預測

利用DNASTAR軟件中的Protean板塊分析蛋白抗原性、親水性、柔韌性、表面可及性的結果如彩版封三圖6所示，綜合分析得出親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段(表1)。

圖6 DNASTAR軟件預測蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性

表1 FimD、PilN蛋白親水性、柔韌性、抗原性和表面可及性都較好的肽段預測

2.4 FimD、PilN蛋白的三級結構分析 利用SWISS-MODEL進行同源建模，同源建模也可稱比較建模，是利用已知的同源蛋白質的結構建立目的蛋白質的結構模型。FimD蛋白、PilN蛋白三級結構預測結果如圖7所示，FimD蛋白選取3rfz.1.B作為模板，全局模型質量評估(GMQE)結果為0.78,QMEAN為-2.01,相似性為56.81%；PilN蛋白選取3ezj.1.A作為模板，GMQE結果為0.10,QMEAN為-4.44,相似性為12.78%，所有圖中都存在α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規則卷曲，與二級結構分析的結果相符合。

圖7 FimD蛋白、PilN蛋白三級結構預測

2.5 FimD、PilN蛋白的優勢B細胞表位預測 采用BepiPred預測的蛋白B細胞表位結果如表2所示，Immunomedicine Group預測的蛋白B細胞表位結果如表3所示。參照高瞻等[7]的方法進行最終的蛋白優勢B細胞表位預測，由于表位大多出現在表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好的肽段，并且目前預測B細胞表位的在線工具都未達到百分之百的準確率，因此需要選取用BepiPred預測的B細胞表位結果和用Immunomedicine Group預測的B細胞表位結果的共同部分，并綜合DNASTAR軟件、SOPMA分析的結果，選出表面可及性、抗原性、柔韌性、親水性都較好并且沒有α螺旋的肽段，預測出最終的蛋白優勢B細胞表位。最終預測出FimD蛋白潛在的優勢B細胞表位為：7～18、144～152、307～315、365～373；PilN蛋白潛在的優勢B細胞表位為：77～86、138～149、516～524。

表2 BepiPred方法預測蛋白B細胞表位的肽段位置

表3 Immunomedicine Group方法預測蛋白B細胞表位的肽段位置

3 討論

大腸肝菌(Escherichiacoli,E.coli)引起的腦膜炎是一個復雜的多步驟過程，包括從腸黏膜的定植到進入血液循環并形成高水平的菌血癥，然后進一步穿過血腦屏障，進入腦脊液最終引起腦膜炎[8]。黏附是NMEC致病機理中的第一步，也是穿越血腦屏障的重要一步。E.coli對構成血腦屏障的腦微血管內皮細胞的黏附被認為是其侵入中樞神經系統的重要因素[9]。菌毛與E.coli的黏附、定植和致病都有著非常密切的關系[10]，FimD和PilN都屬于菌毛的亞單位蛋白，在菌毛的組裝中起著重要的作用[11-12]。

表位是蛋白抗原性的基礎,而且與機體的固有免疫、獲得性免疫等密切相關，表位的研究對于疾病的診斷和分子疫苗的設計有至關重要的意義[13]。隨著生物信息學研究領域的不斷發展和創新，生物信息學被廣泛地應用[14]，目前，對蛋白質結構與功能進行生物信息學技術分析已經成為大多表位和疫苗研究的首選方法[15]，與傳統的試驗方法相比，生物信息學技術使蛋白結構分析和表位的預測更加準確和簡便[16]。表位大多出現在蛋白表面可及性強、柔韌性好、親水性和抗原指數高的肽段[17]，以及結構較松散，易扭曲、盤旋并展示在蛋白表面的β轉 角及無規則卷曲和該蛋白的膜外區域，從而有利于抗體結合[18]。

本試驗利用生物信息學方法綜合分析FimD和PilN表面可及性、柔韌性、蛋白親水性、抗原指數、二級結構、三級結構等參數來預測B細胞表位。結果顯示，FimD和PilN蛋白的膜外區域占較高比例，因此可能被抗原遞呈細胞接觸并引發免疫應答。蛋白二級結構和三級結構分析結果顯示，FimD蛋白的β轉角和無規則卷曲占61.52%，PilN蛋白的β轉角和無規則卷曲占55.72%，2個蛋白的β轉角和無規則卷曲所占比例之和大于50%。BepiPred-2.0基于隨機森林算法提供了最先進的基于B細胞表位序列的預測[19]，與其他可用工具相比，該表位被認為具有更高的質量，并且確實顯著提高了預測能力[20]。Immunomedicine Group使用Kolaskar和Tongaonkar的方法預測表位，只有當最小氨基酸殘基大小為8個時才被報告，該方法的準確性約為75%[21]。IEDB為科學界提供了表位數據的開放訪問，以及表位預測和分析工具，收集了最廣泛的試驗驗證的B細胞和T細胞表位數據[22]。分別使用在線預測工具BepiPred和Immunomedicine Group預測出FimD蛋白具有11個和14個B細胞表位肽段，PilN蛋白具有12個和23個B細胞表位肽段。現已有的預測B細胞表位的在線工具均未達到百分之百的準確性。本試驗選取除去信號肽和跨膜區后的肽段，綜合分析FimD、PilN蛋白在不同在線預測工具得出的B細胞表位預測結果以及DNASTAR軟件分析得出的2個蛋白表面可及性、柔韌性、抗原性、親水性較好的肽段，選取共同部分最終確定潛在的優勢B細胞表位。綜上所述，FimD、PilN蛋白具有很多潛在的抗原表位，推測這2個蛋白具有良好的免疫原性，但還需要在后期的試驗中進一步驗證。本試驗預測篩選得到的FimD、PilN蛋白潛在表位可為牛源致腦炎大腸桿菌多表位疫苗的研發提供基礎數據。