香連丸對2型糖尿病大鼠早期肝損傷的保護作用

張志豪　李竣　何志勇　石召華　黃先菊

【摘 要】目的：探究香連丸對高脂飲食聯合小劑量鏈脲佐菌素（Streptozotocin， STZ）誘導2型糖尿病大鼠肝臟的保護作用。方法：SD大鼠共60只，隨機分出8只作為正常對照組，其余采用高脂飲食聯合STZ一次性腹腔注射建立T2DM模型。將糖尿病建模成功的大鼠隨機分為4組，分別為模型組、陽性對照組（二甲雙胍140 mg/kg）、香連丸低劑量組（150 mg/kg）和香連丸高劑量組（300 mg/kg），每組8只。灌胃給藥6周后進行口服葡萄糖糖耐量試驗（OGTT），檢測血清中空腹血糖（FBG）、谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）以及堿性磷酸酶（ALP）等肝功能水平，以及總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、尿酸（UA）、尿素（UREA）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）水平，白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平。結果：與正常組比較，模型組大鼠FBG、血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、TC、TG、UREA、IL-6、TNF-α、MDA水平極顯著性升高（P<0.01），ALB-Ⅱ、T-SOD水平極顯著性下降（P<0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、UA、IL-6、MDA水平極顯著性下降（P<0.01），香連丸低劑量組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、T-SOD、MDA水平極顯著性下降（P<0.01），香連丸高劑量組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、UA、T-SOD、MDA水平極顯著性下降（P<0.01）。結論：香連丸能夠改善2型糖尿病大鼠肝臟功能，對2型糖尿病造成的肝臟損害具有一定的保護作用。

【關鍵詞】 香連丸;2型糖尿病;肝損傷;保護作用

【中圖分類號】R285.6 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2022）01-0026-05

Protective Effect of Xianglian Pill on Early Liver Injury in Type 2 Diabetic Rats

ZHANG Zhihao¹Li Jun¹HE Zhiyong¹SHI Zhaohua²HUANG Xianju

1.?School of Pharmaceutical Sciences， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China;

2.Center of Experimental Teaching and Laboratory Management， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China;

3.Wuhan Aimin Pharmaceutical Co， Ltd.Ezhou 436070， China

Abstract：Objective To explore the protective effect of Xianglian Pills on the liver of rats with type 2 diabetes （T2DM） induced by high-fat diet combined with low-dose streptozotocin （Streptozotocin STZ）.?Methods A total of 60 SD rats were randomly divided into 8 rats as the normal control group， and the rest were treated with a high-fat diet combined with a one-time intraperitoneal injection of STZ to establish a T2DM model.?The rats with successful diabetes modeling were randomly divided into 4 groups： model group， positive control group （metformin， 140 mg/kg）， Xianglian Pill low-dose group （150 mg/kg） and Xianglian Pill high-dose group （300 mg/kg） ）， 8 per group.?After 6 weeks of intragastric administration， an oral glucose tolerance test （OGTT） was performed to detect serum fasting blood glucose （FBG）， aspartate aminotransferase （AST）， alanine aminotransferase （ALT） and alkaline phosphatase （ALP） and other liver function levels ， Total cholesterol （TC）， triacylglycerol （TG）， uric acid （UA）， urea （UREA）， malondialdehyde （MDA）， total superoxide dismutase （T-SOD） levels， interleukin 6 （IL-6） ）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） levels were also detected.?Results Compared with the normal group， the FBG and serum ALT， AST， ALP， γ-GT， TC， TG， UREA， IL-6， TNF-α and MDA levels in the model group increased significantly （P<0.01） ， ALB-Ⅱ and T-SOD levels The levels of ALB-Ⅱ and T-SOD decreased significantly （P<0.01）.?Compared with the model group， the levels of ALT， AST， γ-GT， UA， IL-6， and MDA in the serum of the metformin group decreased significantly （P<0.01）.?The levels of ALT and AST in the serum of the Xianglian Pill low-dose group ， γ-GT， T-SOD， MDA levels decreased significantly （P<0.01）， and the levels of ALT， AST， γ-GT， UA， T-SOD， MDA in the serum of rats in the Xianglian Pill high-dose group were extremely significantly decrease （P<0.01）.?Conclusion Xianglian pills can improve the liver function of type 2 diabetic rats and have a certain protective effect on liver damage caused by type 2 diabetes.

Key?words：Xianglian Pill; Type 2 Diabetes Mellitus; Liver Injury; Protective Effect

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的慢性代謝性疾病，其并發癥是導致糖尿病患者致死致殘的主要原因。過去人們對糖尿病的聚焦點主要在神經損害、血管損害及腎損害，而肝臟作為調節血糖最重要的器官，是參與機體糖代謝的重要組織之一。由于肝臟代償功能較強且早期肝損傷不明顯等因素，糖尿病肝損傷不易引起人們的關注。近年來，隨著糖尿病發病率的急劇增高，糖尿病肝損傷的發病率也顯著增高。糖代謝紊亂容易導致高血糖癥的發生，引起糖原在肝臟堆積并引發肝臟微血管病變，損傷肝功能，其中以非酒精性脂肪肝最為常見。

香連丸是治下痢的古代名方，可清熱燥濕，行氣止痛。中成藥香連丸為黃連和木香以相使配伍的關系組成，處方均為黃連（吳茱萸制）與木香4∶1，用于濕熱痢疾，里急后重，腹痛泄瀉，菌痢，腸炎。現代研究發現，香連丸可治療胃潰瘍、腹瀉、潰瘍性結腸炎、及細菌性感染等。但未見其對糖尿病引起的肝臟損傷的保護作用的相關報道。本研究采用高脂飲食聯合小劑量STZ一次性腹腔注射建立2型糖尿病（Type2 diabetes mellitus T2DM）大鼠模型，探討香連丸對T2DM大鼠肝臟的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級Sprague-Dawley （SD）大鼠60只，體重160～180 g，購于華中農業大學實驗動物中心，許可證號：SCXK-（遼）2015-0001。飼養于中南民族大學實驗動物中心SPF動物房。實驗動物基礎飼料（武漢萬千佳興生物科技有限公司）;動物福利和實驗過程符合美國國立衛生院（NIH）準則，并經中南民族大學倫理委員會（編號：SYXK2016-0089）批準。實驗溫度20～25 ℃，濕度40%～70%，光照或者黑暗條件下讓老鼠自由進食。為避免食物干擾，老鼠在實驗前12 h禁食不禁水。

1.1.2 藥物與試劑 香連丸（批號：20190404，湖北香連藥業有限責任公司）;鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ，批號：EZ2921B400，BioFroxx公司）;D12451高糖高脂飼料（批號：11126720000 33501，小黍有泰（北京）生物科技有限公司）;鹽酸二甲雙胍緩釋片（批號：20181026，武漢愛心康大藥房）;谷草轉氨酶（Aspartate aminotransferase，AST，批號：140219005）、谷丙轉氨酶（Alanine aminotransferase，ALT，批號：140119007）、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP，批號：1403190 05）、白蛋白（Albumin，ALB，批號：148319001）;γ-谷氨酰轉移酶（Gamma glutamyltransferase，γ-GT，批號：141519008）;尿酸（Uric acid，UA，批號：141219004）;尿素（Urea，UREA，批號：141319002）;總膽固醇（Total cholesterol，TC，批號：141618014）;甘油三酯（Triglyceride，TG，批號：141719003）測定試劑盒均為武漢嘉晟瑞康科技有限公司;Rat TNF-α ELISA Kit試劑盒（批號：080620190709，上海碧云天生物技術有限公司）;Rat IL-6 ELISA Kit試劑盒（批號：20191011，武漢安特捷生物科技有限公司）;大鼠總超氧化物歧化酶（T-SOD）ELISA試劑盒（批號：MM-0731 R1，江蘇酶免實業有限公司）;丙二醛（MDA）測試盒（批號：01910170，北京邁瑞達科技有限公司）;檸檬酸鈉及檸檬酸、無水葡萄糖、烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 動物的造模、分組及給藥 60只大鼠隨機分出8只作為正常對照組，喂養普通飼料;其余52只大鼠喂養高脂飼料4周，然后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素40 mg/kg，建立T2DM模型。正常組給予等體積枸櫞酸緩沖液，1周后檢測大鼠空腹血糖（Fasting billd glucose，FBG），血糖濃度高于11.1 mmol/L的大鼠視為造模成功，確認糖尿病模型32只。將糖尿病成模的大鼠隨機分為4組，分別為模型對照組、陽性對照二甲雙胍組、香連丸低劑量組和香連丸高劑量組，每組8只，正常組和模型組大鼠給予等體積生理鹽水，二甲雙胍組大鼠給予140 mg/kg二甲雙胍，香連丸治療組分別給予150 mg/kg和300 mg/kg香連丸灌胃，1次/d，共6周。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 動物每周稱重，密切觀察動物精神狀態、反應性、毛發色澤、飲食及排泄狀況。稱重，記錄體重以及死亡情況。

1.3.2 空腹血糖和口服糖耐量（OGTT）實驗 各組大鼠灌胃給予香連丸治療6周后進行OGTT實驗，實驗前禁食12 h，尾靜脈取血病檢測空腹血糖水平，然后每只大鼠灌胃給予葡萄糖溶液2.5 g/kg，分別在給予葡萄糖后30，60，120 min采血，并測定血糖值（三諾安穩血糖儀及試紙條），計算血糖曲線下面積（AUC）。血糖AUC=1/4×BG（0 min）+1/2×BG（30 min）+3/4×BG（60 min）+1/2×BG（120 min）。

1.3.3 血清中相關生化指標檢測 末次灌胃給藥后，大鼠禁食12 h，采用烏拉坦（100 mg/kg）進行麻醉，經腹主動脈取血，離心并分離血清，用全自動生化分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，Mindray BS-240VET型）檢測血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰胺轉移酶（γ-GT）、白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、尿素（UREA）。試劑盒檢測總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）。

1.3.4 TNF-α，IL-6含量檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清TNF-α，IL-6含量。嚴格按試劑盒說明書步驟操作。

1.4 統計學處理 采用Excel軟件進行數據處理，應用SPSS 25.0軟件進行分析。數據均以均數加減標準差（x±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示差異有高度統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 正常組大鼠健康狀態良好，進食、飲水均正常，糞便成形，毛色光澤;模型組大鼠進食量增加、飲水增加、尿量增多、活動減少、精神萎靡，被毛蓬松無光澤;相較于模型組，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組有明顯改善。

給予受試體樣品干預期間，每周對實驗大鼠的體重進行測定，實驗結果如表1所示，與正常組大鼠比較，模型組大鼠體重水平極顯著性下降（P<0.01）;與模型組大鼠體重比較，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組沒有顯著性差異。在整個治療期間，正常組、模型組、二甲雙胍組、香連丸低、高劑量組沒有死亡。

2.2 香連丸對實驗大鼠空腹血糖的影響 給予受試體樣品干預期間，每周對實驗大鼠的空腹血糖值進行測定，與正常組大鼠比較，模型組大鼠空腹血糖水平極顯著性升高（P<0.01）。給予受試樣品4周后，與模型組大鼠空腹血糖比較，二甲雙胍組大鼠空腹血糖水平顯著性下降（P<0.05）。見表2。

2.3 香連丸對實驗大鼠糖耐量的影響 正常組、模型組、二甲雙胍組以及香連丸低、高劑量組在葡萄糖灌胃后的60 min血糖達峰值，在接下來的60 min內，正常組血糖逐漸下降，在灌胃120 min后基本恢復到正常血糖值;而模型組血糖值緩慢下降，其血糖水平與正常組、二甲雙胍組以及香連丸給藥低、高劑量組相比較一直維持在較高水平。與正常組比較，模型組血糖曲線下面積（AUC）極顯著性升高（P<0.01）。與模型組比較，香連丸高劑量組AUC顯著性下降（P<0.05）。二甲雙胍組、香連丸低劑量組AUC雖然低于模型組，但是無顯著性差異。以上結果表明：模型組大鼠對葡萄糖耐受力下降，出現胰島素抵抗，但是香連丸高劑量組可提高機體對葡萄糖的耐受量，改善胰島素抵抗。見表3。

2.4 對肝腎功能和血脂的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP、γ-GT、UREA、TC、TG水平極顯著性升高（P<0.01），模型組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平極顯著性降低（P<0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT、UA水平極顯著性降低（P<0.01），二甲雙胍組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平顯著性升高（P<0.05）;香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALT、AST、γ-GT水平極顯著性降低（P<0.01），香連丸高劑量組大鼠血清中UA水平極顯著性降低（P<0.01），香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALP、TC、TG水平顯著性降低（P<0.05），香連丸低、高劑量組大鼠血清中ALB-Ⅱ水平顯著性升高（P<0.05），香連丸低劑量組大鼠血清中UA水平顯著性降低（P<0.05）。見表4、表5。

2.5 對T-SOD、MDA水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中的T-SOD水平極顯著性降低（P<0.01），模型組大鼠血清中MDA水平極顯著性升高（P<0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組T-SOD水平顯著性升高（P<0.05），香連丸低、高劑量組極顯著性升高（P<0.01），二甲雙胍組、香連丸低、高劑量組大鼠血清中MDA水平極顯著性降低（P<0.01）。見表6。

2.6 對TNF-α、IL-6水平的影響 連續6周灌胃給藥后發現模型組大鼠血清TNF-α的水平明顯升高。與正常組比較，模型組大鼠血清中的IL-6、TNF-α水平極顯著性升高（P<0.01）。與模型組比較，二甲雙胍組IL-6水平極顯著性降低（P<0.01），二甲雙胍組TNF-α水平顯著性降低（P<0.05）。見表7。

3 討論

肝臟是調節糖代謝的重要器官，肝損傷是常見的糖尿病慢性并發癥之一，糖尿病合并肝損傷時肝臟糖代謝出現紊亂，使血糖進一步升高，形成惡性循環。高血糖會增加自由基的產生，并誘導氧化應激，從而引發肝臟損傷和碳水化合物代謝紊亂。目前對糖尿病的治療主要是以控制血糖、糾正糖代謝紊亂，減少及預防并發癥為主。

實驗通過高脂飼料聯合小劑量STZ腹腔注射的方法誘導制備T2DM大鼠模型。高脂飲食使大鼠體內產生胰島素抵抗，再通過小劑量STZ腹腔注射破環部分胰島β細胞，使其體內胰島素分泌相對不足，造成T2DM大鼠模型。實驗中大鼠出現多尿、多飲、多食及體重下降等臨床表現。研究結果顯示：香連丸可明顯降低高脂飲食聯合STZ誘導的糖尿病大鼠空腹血糖，改善糖耐量，顯示出良好的治療效果。

T2DM大鼠伴有肝功能異常主要表現為ALT、AST、ALP明顯升高，SD大鼠造模后，與正常組比較，模型組大鼠血清中AST、ALT、ALP水平極顯著性升高，說明大鼠肝細胞受損嚴重。經過6周的治療后，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清AST、ALT、ALP水平有不同程度的下降。研究結果顯示：香連丸對T2DM大鼠早期肝損傷具有保護作用。當肝細胞受損時，ALT和AST從胞漿釋放入血，血清中這兩種酶的活性在短時間內升高，由此判斷肝細胞損傷程度。

MDA水平可直接反映機體細胞自由基損傷程度。SOD是機體內對抗氧化自由基重要蛋白酶，在清除超氧陰離子以及調節體內氧化與抗氧化平衡方面起著主要作用，是機體內抗氧化與抗氧化平衡方面起著關鍵性的作用。胡愛明等采用小劑量STZ建立糖尿病模型，發現模型組大鼠血液和肝組織MDA明顯增高，SOD等抗氧化酶的活性卻降低，證實糖尿病肝組織也存在著明顯的氧化應激，這些氧化應激導致組織和細胞的損傷。經過6周的治療后，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清MDA水平有不同程度的下降，T-SOD水平均高于模型組。結果顯示：模型組大鼠血液的MDA明顯增高，T-SOD抗氧化酶的活性卻降低，說明香連丸可能通過抑制細胞內脂質過氧化反應進而減輕糖尿病肝損傷。

炎癥細胞因子如TNF-α、IL-6水平的升高與糖尿病嚴重程度有關，減輕炎癥可以改善胰島素抵抗。研究結果顯示：模型組大鼠血清IL-6、TNF-α水平升高，二甲雙胍組和香連丸低、高劑量組大鼠血清炎癥因子有不同程度的下降，表明香連丸可通過抑制炎癥反應來保護受損肝細胞。

綜上所述，香連丸能夠降低血糖，改善糖耐量，同時也能夠調節血脂的TC和TG，以及增強機體的抗氧化能力，對糖尿病早期肝損傷具有一定的保護作用。

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（收稿日期：2021-05-14 編輯：陶希睿）