Gene Xpert MTB/RIF Ultra檢測各類標本的陽性率統計分析

閆曉煜

摘要：目的 使用快速高敏結核分枝桿菌群及利福平耐藥基因檢測技術（Gene Xpert/RIF Ultra）檢測臨床常見標本，統計各類標本的陽性率，評估在肺結核病中的診斷價值。方法 選取2021年1月1日～2022年1月1日來我院治療并進行過Xpert/RIF Ultra檢測的患者，符合入選標準的共5890例，其中檢測標本為痰液1848例，標本為肺泡灌洗液2634例，其余為組織或其他體液標本1408例。結果 痰液標本中的陽性率為32.25%，肺泡灌洗液的陽性率為35.42%，其他標本總的陽性率為28.56%，全部標本的陽性率為30.08%。結論 Xpert/RIF Ultra檢測肺泡灌洗液標本和痰液標本有較高的陽性率;對于無法咳痰或難以取得合格痰液標本的患者，使用肺泡灌洗液標本進行檢測很有價值。

關鍵詞：結核病，肺泡灌洗液，Gene Xpert

結核病是由結核分枝桿菌傳染而引起的一種慢性傳染性疾病，其中以肺部感染最常見，臨床上可累及機體多個器官。結核病的主要臨床癥狀為午后低熱、盜汗、乏力、消瘦、咳嗽咳痰、咯血、呼吸困難等，對患者的生活質量與生命健康有著嚴重的影響。研究表明，結核桿菌入侵人體后有不同時長的潛伏期，所以臨床早診斷、早治療非常必要，患者大多可臨床治愈，預后良好。結核桿菌培養是臨床診斷結核病的金標準，但是培養周期長，難以獲得及時有效的實驗室檢測依據。因此，早期快速診斷成為目前結核病防控面臨的主要問題。

臨床上，分子生物學方法是一類高敏感的檢測方法和技術，能夠對樣本中的結核桿菌核酸直接檢測，不僅可以提升結核病的檢出率和診斷效率，而且能夠對結核患者及早進行有效的治療管理。目前，常見的方法有實時熒光核酸恒溫擴增技術（SAT-TB）、γ干擾素釋放試驗（T-SPOT.TB）、肺結核核酸（TB-DNA）定量。SAT-TB是對臨床收集的痰液進行液化處理后，加入核酸提取劑100℃10min后提取核酸，最后將提取物進行上機擴增。該方法是在恒溫下進行，大大縮短了反應時間，得到結果相對快捷，缺點是實驗抗干擾能力差，易出現假陰性，且對痰液中的菌量下限有要求，當標本中抗酸桿菌低于100 CFU/ml時，不易檢出。γ干擾素釋放試驗是采集患者外周靜脈血清5ml，置于肝素抗凝管內，并及時將血液加入培養管中，37℃培養16h以上，第二天將培養管離心對血清進行ELISA檢測，最終用酶標儀測量并分析結果。此方法靈敏度高，臨床應用廣泛，但無法為活動性結核與陳舊性結核提供鑒別診斷的依據。TB-DNA最常見的分子生物學檢測方法，臨床采集患者標本后，實驗室對標本進行預處理，待分枝桿菌核酸提取等工作完成后，用熒光定量檢測試劑盒檢測，在PCR擴增儀（美國ABI，7500）上進行擴增，利用標準曲線法計算出DNA表達量，結果以>400拷貝為陽性，反之為陰性。熒光定量PCR法有內標通道對整個實驗過程進行監測，結果相對準確，但擴增時間相對較長，而且核酸提取的過程均為手工操作，預處理花費的時間和精力相對較大。因此，亟須推廣自動化的檢測方法，減輕檢測工作人員的工作負擔，提高實驗室操作的生物安全性。

根據中華人民共和國衛生行業標準肺結核診斷WS 288—2017的標準[1]，超敏結核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測（Gene Xpert/RIF Ultra，簡稱Gene Xpert）在結核病診斷中，表現出檢測靈敏度相對較高，且特異度也不低，能夠更快地為臨床提供早期診斷依據，在臨床結核病診斷方面具有非常好的應用前景。GeneXpert系統自進行純化核酸擴增、單一或復雜樣本中的目標序列測定。該系統使用單份/一次性的Xpert檢測匣，檢測匣內裝有PCR反應試劑，以獨立進行PCR處理，由于試劑盒采用自成一體的封閉設計，因此使得樣本間的交叉污染最小化。目前，臨床上最常見的標本類型為痰液和肺泡灌洗液，但由于結核病還存在肺外結核，例如泌尿系結核、消化道結核、結核性腦膜炎及其他局部組織結核感染病等，且Gene Xpert檢測費用比較高，這在一定程度上阻礙了其在臨床上的推廣。因此，對其他類型標本的檢測數據進行回顧性分析，檢測肺外結核病患者標本類型的陽性率及效能評價十分重要。

1對象與方法

1.1 研究對象

采用回顧性研究方法選取2021年1月1日～2022年1月1日就診于我院的5890例患者作為研究對象。其中，檢測標本為痰液1848例，標本為肺泡灌洗液2634例，其余為組織或其他體液標本1408例，包括組織、引流液、引流條、血液、胸腹水、心包積液、胃液、刷檢物、手術切除標本、傷口分泌物、皮損分泌物、膿腫穿刺液、尿液、腦脊液、關節液、骨髓、宮頸分泌物等。患者年齡范圍為1～98歲，男性3472例（58.9%），女性2418例（41.1%）。痰液標本中的陽性率為32.26%，肺泡灌洗液的陽性率為35.42%，其他標本總的陽性率為28.56%，全部標本的陽性率為30.08%。

1.2? 檢測方法

嚴格按照產品說明書進行操作，根據樣本的形狀，取標本處理液2ml對1ml標本（1～2倍樣本體積處理液）進行液化處理，避免檢測標本中有明顯顆粒物或者血液，充分振蕩10～15s，然后將樣本室溫下靜置15min，在靜置5～10min時再次用力振蕩10～20次，保證樣本充分液化，不應有未液化的痰液細小塊狀物。根據樣本檢測數量準備Xpert MTB/RIF檢測匣，并在檢測匣側面標注樣本編號。打開檢測匣的蓋子，使用試劑盒內提供的無菌移液管吸取液化前處理好的樣本2ml以上（如果樣本量不足，不要進行下一步），由檢測匣的加樣孔緩慢加入（避免形成氣溶膠），關閉檢測匣蓋子。其余液化樣本可保存于2～8℃達12 h，以備重復檢測使用。結果判讀與解釋：XpertMTB/RIF檢測結果儀器測量熒信號和內設的計算算法來判斷，由系統直接報告結果，并在“預覽結果”（ViewResults）窗口顯示。結核分支桿菌檢測基于樣本中分支桿菌的 Ct值，結核分支桿菌結果將以高、中、低或非常低來顯示。結果分為：檢測到利福平耐藥、未檢測到利福平耐藥、利福平耐藥不確定。其中，只有在檢測到結核分枝桿菌的情況下，才顯示利福平耐藥的檢測結果。

1.3 統計方法

采用SPSS 19.0統計軟件，計數資料數據用（%）表示，組間比較采取卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

痰液組和肺泡灌洗組分別與其他類型標本組進行比較，P<0.05，差異有統計學意義。見表1。

3討論

近十年來，由于艾滋病患者、糖尿病患者、老年人等特殊人群的數目增長，流動人口增加，多重耐藥性結核桿菌增多，以及部分國家地區對結核控制的忽視等因素，全球結核病防控形勢十分嚴峻[2]。傳統結核診斷技術涂片鏡檢法以及結核分枝桿菌培養法盡管有一定的特異性，但都存在不足，如齊尼抗酸染色法涂片鏡檢敏感度低，容易漏檢;培養法耗時長，容易導致延誤診療，這也是造成結核難以有效被控制的原因之一[3]。眾所周知，作為目前臨床重要的一線抗結核藥物，利福平和異煙肼的耐藥現象十分嚴重，即大部分菌株對利福平耐藥的同時，也對異煙肼有耐藥性。因此，利用GeneXpert MTB/RIF檢測利福平耐藥性可作為多重耐藥結核桿菌（MDR-TB）的篩選標志，對臨床的用藥治療也能提供一定的參考價值。

通常，痰液中檢出結核菌是診斷患者患有活動性肺結核病的主要依據，因為存在于肺部病灶壞死組織的大多數結核分支桿菌是通過痰液排出體外的。目前，傳統的羅琴氏（LJ）固體培養法陽性率不高，且特異度差，因為各種非結核分枝桿菌（NTM）均可生長，需要結合菌種鑒定方可確定是否為結核分枝桿菌。抗酸染色涂片雖然檢測便捷即時，但當標本中的結核分支桿菌數目低于5000條/ml時，極易漏檢[4～5]。美國賽沛公司推出的檢測技術有著極高的靈敏度，在痰標本中的檢測下限為131 CFU/ml，遠高于傳統的鏡檢法及其他檢測方法;并且GeneXpert MTB/RIF檢測技術有操作簡便、生物安全性高、抗干擾能力強等特點[6]。近年來，國內外對此項技術的檢測敏感性和特異度做了許多回顧性研究，有結果顯示，GeneXpert MTB/RIF診斷結核病的特異度達99.2%，靈敏度為 92.2%[7]。針對我院標本種類繁多的情況，本次研究將臨床進行了Xpert MTB/RIF的所有患者進行統計，結果顯示各種類型標本的陽性率存在明顯差異，且說明Xpert MTB/RIF技術在檢測不同標本時，敏感度存在差異，但都顯示很高的特異度。而肺泡灌洗液陽性率稍高，可能是與臨床留取痰標本的合格率有關。因為研究中有學齡前兒童及高齡患者，這類人群很難正確咳痰，送檢的標本中唾液較多，對檢測結果的陽性率有嚴重影響。所以，一次檢測的陰性結果并不能排除結核病，需不同日期多次留取痰液檢測才能提高陽性率，對他們而言，留取肺泡灌洗液標本可能更為合適。

雖然Xpert MTB/RIF有優點很多，但也存在些問題及局限性，例如對臨床留取痰液標本質量的要求很高;各類標本的前處理也十分重要，食物殘渣、血紅蛋白、藥物等對結果有一定影響;結果回報的結核桿菌復合群，不能區分標本中的結核分枝桿菌是死菌或活菌等。因此，盡管傳統羅氏培養耗時長需要4～8周;抗酸染色鏡檢法敏感性低，涂片質量以及工作人員閱讀能力不同，易造成誤診或漏檢;恒溫結核RNA檢測技術的抗干擾能力差，但結合上Xpert MTB/RIF的快速、高靈敏度和特異度這項新診斷技術，能有效對臨床提供病原學診斷依據。

綜上所述，Xpert/RIF Ultra檢測肺泡灌洗液標本和痰液標本有較高的陽性率;對于無法咳痰或難以取得合格痰液標本的患者，使用肺泡灌洗液標本進行檢測很有價值。Xpert MTB/RIF檢測技術適合在實驗室條件不高的臨床試驗室推廣使用，但該技術也存在一定缺陷，需與結核分枝桿菌的其它檢測方法相結合，進一步提高結核分枝桿菌的正確檢出率。

參考文獻

[1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.WS288-2017肺結核診斷.2017-11-09.

[2] 黃建斌，楊玲，梁曉莉.Gene Xpert MTB/RIF檢測技術在結核病診斷中的應用探討[J].醫學動物防制，2017，33（4）：465，467.

[3] 張治國，歐喜超，孫倩，等.利福平耐藥實時熒光核酸擴增技術檢測痰標本中結核分枝桿菌及其耐藥性研究[J].中國防癆雜志，2013，35（1）：13-16.

[4] 劉佳慶，張麗霞，秦中華，等.Xpert MTB/RIF和 T-SPOT TB對涂陰肺結核診斷價值的評估[J].臨床檢驗雜志，2016，34（10）：755-757.

[5] 趙永，梁慶福，林淑芳，等.Xpert MTB/RIF 檢測技術用于耐多藥結核分枝桿菌利福平耐藥檢測分析[J].中國衛生檢驗雜志，2015，25（15）：2621-2622，2628.

[6] 付沛文，李世寶，李洪春，等.Xpert MTB/RIF試驗快速診斷結核病的研究進展[J].中國感染控制雜志，2017，8（16）：779-783.

[7] 王怡心，陳雄豪，林惠玲，等. Xpert MTB/RIF技術在基層實驗室結核病診斷中的應用研究[J].分子診斷與治療雜志，2015，5（7）：176-179，192.