以分子工具為鑰，解腸道菌群之密

李文博

腸道菌群是近年來微生物學、醫(yī)學、基因組學等領(lǐng)域引人關(guān)注的研究焦點。

人自出生后，外界的微生物就會逐漸進入人體。在正常情況下，人體和共生菌群之間，以及共生菌群各細菌之間，會保持一定的生態(tài)平衡，如果平衡失調(diào)，就有可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。其中，人體腸道內(nèi)有數(shù)萬億個細菌與人類共生，它們廣泛參與和影響人體的代謝活動、抵御感染和自體免疫疾病的患病風險，還能控制人體對一些癌癥治療藥物的反應(yīng)。但因為基于脫氧核糖核酸（DNA）測序、細菌分離培養(yǎng)、基因工程等方法的傳統(tǒng)研究思路在菌群復(fù)雜功能的深入研究中存在一些技術(shù)瓶頸，關(guān)于腸道菌群仍有諸多懸而未解的難題。

針對這一系列問題，上海交通大學醫(yī)學院副研究員王煒認為：化學的研究工具和思路有巨大的應(yīng)用空間和科學價值。他自博士階段即致力于針對與人類健康密切相關(guān)的復(fù)雜細菌體系開發(fā)新的化學研究工具與方法，竭盡全力，除人類之病痛，助健康之完美。

心懷向往?堅持不懈

王煒的母親是一位藥劑師，由于父母工作的原因，他自幼便生活在基層醫(yī)院的大院環(huán)境中。在王煒的感受中，醫(yī)院是溫情的。這里承載著他美好的童年，給予了他最初對醫(yī)生這一職業(yè)的美好向往。

2003年，非典暴發(fā)，彼時是王煒進入山東大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)學習的第二個年頭。這是他親身經(jīng)歷過的第一件關(guān)乎全人類生命健康安全的大事件，醫(yī)護人員在此時發(fā)揮的作用、作出的巨大貢獻、展現(xiàn)出的希波克拉底精神，使王煒產(chǎn)生了一種朦朧但強烈的責任感和使命感，自此加倍努力，精益求精。

“救死扶傷”是王煒給自己定下的終身目標，但他卻并未在畢業(yè)后順勢成為一名臨床醫(yī)生，反而輾轉(zhuǎn)萬里到美國密蘇里大學，拜入生物化學系托馬斯·馬維尼（Thomas?Mawhinney）教授的門下。他是這樣回答面試問題的：“我希望能學一門新的知識，結(jié)合我的醫(yī)學教育背景，將來可以做些不一樣的，并且能真真切切幫助到廣大病人的研究。”事實上，當時馬維尼教授已年逾70，早已數(shù)年不再招收新的學生，卻還是為了這樣一名心系人類健康的淳樸學子而破例，招錄了王煒。

在美國密蘇里大學生物化學系學習和研究的6年，王煒打下了堅實的科研基礎(chǔ)，豐富了與臨床醫(yī)生的合作經(jīng)驗，加深了對臨床病癥的認識和對醫(yī)學事業(yè)的熱愛與執(zhí)著，這在很大程度上要歸功于他的導(dǎo)師。跟隨導(dǎo)師進行科學研究的日子里，王煒開始致力于針對細菌生物膜研究開發(fā)新的化學探針，幾乎沒有化學和微生物研究背景的他經(jīng)過幾年努力，逐漸取得了長足進步：“在實驗室鍛煉幾年以后，我開始敢于嘗試分子工具設(shè)計，獨立進行探針分子合成了。”按照王煒自己的話來說，這種“不怕犯錯，不懼失敗，敢闖敢拼”的精神是他在博士時期最重要的收獲之一。

在這一時期，王煒跟隨導(dǎo)師的步調(diào)，將囊性纖維化（cystic?fibrosis）導(dǎo)致的肺部長期感染作為主要研究對象。這是一種涉及細菌感染的高致死率疾病，也是高加索人種之中最常見的遺傳性疾病之一。王煒也曾好奇過：導(dǎo)師為什么選擇這樣一種疾病作為研究對象呢？他是從旁人的只言片語中，逐漸拼湊出了導(dǎo)師研究經(jīng)歷：一位法醫(yī)病理學出身的年輕醫(yī)者，因為解剖研究了大量死于囊性纖維化的兒童尸體而立志探究其致病原理，尋找醫(yī)治方法;自學合成化學，一手組建微生物和化學的交叉學科實驗室，在黑暗中摸索著前行，從青絲滿頭到鬢邊斑白……

與導(dǎo)師一同在實驗室和臨床忙碌時，王煒也能從導(dǎo)師與病人接觸的點點滴滴中深刻感受到導(dǎo)師對病人的關(guān)切：“每周的教學工作要花去四十幾個小時，他就在額外的時間里來做基礎(chǔ)研究，不止對患者進行精心治療，對患者家屬也照顧得十分周到。”這位老者總是在盡最大可能減少患者和患者家屬的痛苦，他的堅持、信念自然也對王煒產(chǎn)生了深刻的影響。每當心有迷茫，王煒總會想起非典時期自己沸騰的熱血和那難以言說的感動，也會想起導(dǎo)師的諄諄教誨和偉大的醫(yī)者情懷。這些回憶即便不能幫助他攻關(guān)克難，但總能激起他一往無前的勇氣與決心。

目標明確?奮力前行

自從在本科階段真正樹立了從醫(yī)理想后，王煒幾乎所有關(guān)于科研的重要選擇都帶有明確的目的：前往美國密蘇里大學是為了尋找更適合他的發(fā)展道路，完成“即使不在臨床也能救人”的心愿;前往北京大學是為了學習更多的分子探針技術(shù)以用于微生物學的研究;前往上海交通大學醫(yī)學院是為了繼續(xù)基礎(chǔ)研究的同時能夠和臨床醫(yī)學問題密切結(jié)合。

事實上，博士畢業(yè)回國并加入北京大學陳興教授課題組進行化學生物學的博士后研究后，即便得到了來自陳興教授與團隊的大力指導(dǎo)與幫助，王煒也會時常感到困惑。這是因為當時陳興教授課題組以真核細胞為主要研究對象，而王煒則正因囊性纖維化是白種人特有疾病而面臨方向轉(zhuǎn)變之困。經(jīng)歷了一段艱難的學習與摸索之后，他才最終探索出化學探針與腸道菌群相結(jié)合的研究方向。

2017年，王煒面臨博士后出站問題，但此時此刻他已完全沉浸在新的研究方向之中，渴望進行更進一步的探索，因此主動請求延遲一年出站。一年過去，王煒手頭的研究還未完成，但恰好此時上海交通大學醫(yī)學院分子醫(yī)學研究院正在籌備成立，研究院的楊朝勇副院長向王煒遞去了橄欖枝。“這應(yīng)該是國內(nèi)首個把化學科研機構(gòu)直接設(shè)置在醫(yī)院的研究所。這一方面是我感興趣的科研方向，一方面又圓了我少年時的醫(yī)生夢想。”得益于前期的沉淀與楊朝勇教授和團隊的大力支持，加入上海交通大學醫(yī)學院分子醫(yī)學研究院后，王煒迎來了科研成果的井噴期。

通過發(fā)展活體實時以及原位三維成像，解決了腸道菌群難以在體觀測的問題;通過活體中的熒光D型氨基酸（fluorescent?D-amino?acid，F(xiàn)DAA）探針標記加熒光原位雜交（FISH）聯(lián)用策略，實現(xiàn)了細菌腸道內(nèi)生長分裂方式的成像觀察和生長活性的直接定量……在面向腸道菌群進行研究的過程中，王煒深刻體會到分子工具與化學研究策略在這一極為復(fù)雜的微生物體系中的應(yīng)用價值與潛力，因為有了“武器”和策略才有“戰(zhàn)斗”的資本。

刻苦鉆研?孜孜不倦

“菌群在宿主腸道中的微觀分布可直接影響其生理病理功能”這一認識在近年來逐漸為人們所了解和認可，但菌群在腸道黏膜表面的三維分布是怎樣的？菌群不同的分布會導(dǎo)致哪些對應(yīng)的結(jié)果？影響菌群分布的因素有哪些……一系列問題仍舊是未解之謎。要想解開這些謎題，科研人員必須先掃除來自觀察方面的重重障礙：到目前為止，由于腸道菌群生活環(huán)境較為特殊，且在這一構(gòu)成高度復(fù)雜的微生物體系（300～500種細菌）中，包含著數(shù)目驚人的各類基因（500萬～1000萬）和極為繁復(fù)的生物、化學反應(yīng)過程，大部分腸道細菌仍不能在體外單獨培養(yǎng)，這導(dǎo)致科研人員無法在實驗室對其進行研究;嚴重缺乏菌群成像的工具和手段，導(dǎo)致對腸道菌群的研究難以做到“眼見為實”;分析菌群組成的動態(tài)變化時僅可依靠脫氧核糖核酸測序等間接手段，缺少可對細菌在腸道內(nèi)的生長活性進行直接判定的方法……

針對移植到小鼠體內(nèi)的外源菌群無法活體實時成像追蹤這一痛點，王煒與合作者利用D型炔丙基甘氨酸（D-propargylglycine）探針灌胃對小鼠菌群進行原位代謝標記，進而可通過點擊化學反應(yīng)將篩選后的近紅外Ⅱ區(qū)（NIR-Ⅱ）小分子熒光染料共價偶聯(lián)到細菌表面。這一方法回避了腸道細菌的體外培養(yǎng)，得到的帶有近紅外Ⅱ區(qū)熒光的菌群在保證活性的同時仍可保持完整的組成結(jié)構(gòu)。以此作為供體菌群移植給受體小鼠后，通過銦鎵砷電荷耦合元件（CCD）探測器即可實現(xiàn)活體、無創(chuàng)的菌群實時成像追蹤。

針對固有菌群與宿主腸道微結(jié)構(gòu)的相對空間關(guān)系無法進行三維成像研究這一瓶頸，王煒與合作者開發(fā)了經(jīng)腹腔注射熒光D型氨基酸的腸道菌群在體標記新方法。探針在經(jīng)膽汁分泌進入腸道進而高效標記菌群的同時，也可使宿主組織的熒光吸附背景大為減弱。通過結(jié)合組織透明化（tissue?clearing）策略，他們首次實現(xiàn)了腸道固有菌群的原位、三維、單細菌分辨率熒光成像，能夠為進一步理解腸道菌群的生理功能以及宿主和菌群在不同條件下的相互作用提供獨特的研究工具和視角。

針對腸道菌群中大部分細菌仍無法進行體外單獨培養(yǎng)、難以進行細胞生物學研究的問題，王煒先是實現(xiàn)了對小鼠大部分腸道細菌的雙色序貫熒光標記，繼而通過對這一菌群中不同種屬細菌分別進行熒光原位雜交染色以實現(xiàn)對所感興趣種類細菌進行直接的成像觀察。這一研究策略巧妙地避免了細菌體外培養(yǎng)，利用細菌在腸道內(nèi)原位的生長過程使其帶上具有時序信息的雙色標記，配合熒光原位雜交染色所提供的物種信息，可以高效、方便、準確地獲得各類腸道細菌在體內(nèi)的生長分裂模式信息。利用這一方法，他和團隊成功地對70多個種、屬細菌的生長分裂情況進行了高分辨熒光成像分析，其中包括了多個從未在體外進行過單獨培養(yǎng)和研究的物種，由此得以窺見這些神秘細菌的“廬山真面目”。同時，也針對與宿主免疫系統(tǒng)有密切相互作用的分節(jié)絲狀菌（segmented?filamentous?bacteria，SFB）在宿主腸道內(nèi)的不同生長分化階段進行了細致的成像分析。作為首個可對腸道中的這部分“暗物質(zhì)”進行細胞生物學研究的方法，這一研究策略將會為直觀觀察并深入理解各類腸道細菌在宿主體內(nèi)的微生物活動提供全新的研究角度。

在目前的菌群研究中，往往是通過脫氧核糖核酸測序得出的不同時間點各類細菌相對豐度的變化，來推測相應(yīng)細菌的體內(nèi)活性變化，這導(dǎo)致了無法直觀、準確地對細菌的生長代謝活性進行定量的問題。王煒先是推測并通過嚴謹?shù)膶嶒炞C明了熒光D型氨基酸對體內(nèi)細菌的標記強度與細菌生長代謝速度具有很高的正相關(guān)性，其后結(jié)合熒光原位雜交所得到的細菌種屬信息，成功地通過流式細胞分析定量測得不同細菌在腸道內(nèi)的生長代謝水平。據(jù)此，他開發(fā)了首個能夠直觀、準確地對各類細菌在腸道中的生長代謝狀態(tài)進行定量研究的化學生物學方法，為真正揭示菌群在體內(nèi)受各種內(nèi)外源因素影響時的動態(tài)變化情況提供了有力的技術(shù)支撐。受這一細菌活性定量方法的啟發(fā)，最近王煒又和上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院的臨床醫(yī)生合作，將這一新方法應(yīng)用到病原菌的快速抗生素藥敏檢測之中。通過流式細胞儀分析肺泡灌洗液等臨床樣品中的病原菌在受不同抗生素影響時的代謝活性變化趨勢，可以快速、準確地給出藥物敏感性信息。這一新方法在國際上首次解決了臨床獲得性肺炎病人診斷用藥耗時長而導(dǎo)致病死率高這一難題。

隨著研究的不斷推進，王煒所發(fā)展的這一獨立于傳統(tǒng)測序手段的菌群研究新方法，也越來越為國內(nèi)國際領(lǐng)域同行所關(guān)注和認可。2022年，王煒關(guān)于腸道菌群化學生物學的研究正式獲批立項，他將在為期3年的研究時間里著重開發(fā)選擇性菌群在體標記探針，發(fā)展基于各類化學工具的菌群研究新平臺與成像新方法，并通過這些新工具對不同內(nèi)外源因素如何影響各類腸道細菌的生長代謝狀態(tài)、菌群移位到腸外器官的過程和活性的變化情況等重要科學問題開展研究。他期待著開拓化學工具在腸道菌群研究中的進一步應(yīng)用，為深入理解這一重要微生物體系提供新的化學生物學解決方案。

走過十幾年科研探索的風雨之路，歷經(jīng)無數(shù)次研究失敗與成功之后，王煒依舊牢記并踐行著曾經(jīng)的莊重誓言——獻身醫(yī)學，刻苦鉆研，孜孜不倦。

（責編：袁園）