基于氧化應激損傷和炎癥反應探討中風康復膏對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用

汪湛東 毛忠南 張娜 吳琳 劉婭楠 陶成斌 張延英 宋冰 徐曉艷 王鋼

【摘 要】 目的： 研究中風康復膏（PSR）對腦缺血再灌注損傷（CIRI）模型大鼠中炎癥反應及氧化應激損傷的影響，并探討其治療機制。方法：將50只SPF級SD雄性大鼠隨機分為假手術組、模型組、中風康復膏高劑量組（PSR-H組）、中劑量組（PSR-M組）、低劑量組（PSR-L組），除假手術組外其余組大鼠皆采用線栓法制作大腦中動脈缺血再灌注模型，造模成功后各組分別對應給予PSR或生理鹽水灌胃干預。采用Zea-Longa's標準評分判斷大鼠的神經功能情況并測定腦含水量，TTC染色法觀察腦梗死面積，用分光光度法檢測TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1炎癥因子及MDA、NOS氧化應激損傷指標。結果：與假手術組相比，模型組的神經功能評分、腦含水量、腦梗死面積和TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的含量均顯著升高（P<0.01），而PSR各給藥組神經功能評分、腦含水量、腦梗死面積和炎癥因子的表達量均有所下降，其中PSR-H組、PSR-M組下降較為顯著（P<0.01）。氧化應激指標中，相對于假手術組，模型組MDA含量和NOS活力明顯升高（P<0.01），PSR給藥組MDA含量和NOS活力均有所下降，PSR-H組和PSR-M組下降更為明顯（P<0.01）。結論：中風康復膏能夠改善腦缺血再灌注損傷大鼠神經功能，具有一定保護作用，其機制可能與改善腦部炎癥反應和氧化應激水平有關。

【關鍵詞】 中風康復膏;腦缺血再灌注損傷;氧化應激損傷;炎癥反應

【中圖分類號】R743.31?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2022）16-0015-05

Protective Effect of Paste of Stroke Recovery on Cerebral Ischemia Reperfusion

Injury in Rats Based on oxidative Stress Injury and Inflammatory Reaction

WANG Zhandong1 MAO Zhongnan2 ZHANG Na1 WU Lin1 LIU Yanan1 TAO Chengbin1

ZHANG Yanying1 SONG Bing1 XU Xiaoyan2* WANG Gang2*

1.Gansu University of Chinese Medicine， Gansu province， Lanzhou 730000， China;

2. Affiliated Hospital of Gansu University of Chinese Medicine， Gansu province， Lanzhou 730000， China

Abstract：Objective To study the effects of Paste of Stroke Recovery （PSR） on inflammatory response and oxidative stress injury in rats with cerebral ischemia reperfusion injury （CIRI） model and to investigate its therapeutic mechanism. Methods Fifty SPF male rats were randomly divided into sham-operation group， model group， Paste of Stroke Recovery high-dose group （PSR-H Group）， middle-dose group （PSR-M Group） and low-dose group （PSR-L group）， the model of middle cerebral artery ischemia-reperfusion was made in all groups except sham-operation group， which were treated with PSR or normal saline respectively. The neurological function of rats was evaluated by Zea-Longas standard score and the brain water content was measured， TTC staining was used to observe cerebral infarct area， The indexes of TNF-α， IL-1 β， ICAM-1， VCAM-1 inflammatory factors and MDA， NOS oxidative stress were measured by Spectrophotometer. Results Compared with sham-operated group， the neurological function score， brain water content， cerebral infarct area and the contents of inflammatory factors TNF-α， IL-1β， ICAM-1 and VCAM-1 in model group were significantly increased （P<0.01）， while neurological function score， brain water content， cerebral infarct area and expression of inflammatory factors decreased in each PSR administration group， with more significant decreases in the PSR-H and PSR-M groups （P<0.01）. Meanwhile， in oxidative stress indexes， MDA content and NOS activity were significantly higher in the model group relative to the sham-operated group （P<0.01）， the level of MDA and the activity of NOS in the PSR group were decreased， especially in PSR-H group and PSR-M group （P<0.01）.Conclusions Paste of Stroke Recovery can improve the nerve function of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury， and has some protective effects， which may be related to the improvement of brain inflammation and oxidative stress.

Key words：Paste of Stroke Recovery （PRS）; Cerebral Ischemia Reperfusion Injury （CIRI）; Oxidative Stress Injury; Inflammatory Reaction

缺血性腦血管疾病是一種常見病，因其較高的發病率、致殘率和死亡率給患者及患者家庭和社會均造成了嚴重的影響，且發病年齡出現年輕化的趨勢[1]。腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury， CIRI）是指腦部出現一段時間的缺血后恢復血供，腦部功能不僅未見好轉，反而出現嚴重障礙的一種現象，也是該病發生、發展的關鍵組成部分[2]。

中風康復膏（paste of stroke recovery， PSR）是甘肅中醫藥大學附屬醫院康復醫學科毛忠南主任醫師的治療驗方，在十幾年的臨床診療中對于證屬肝腎虧虛、氣虛血瘀、痰濁阻滯腦竅所致的腦卒中（出血性、缺血性） 恢復期進行干預，效果較為顯著[3-4]。研究通過建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，從抗炎、抗氧化應激兩個角度研究中風康復膏對腦缺血再灌注損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠50只，SPF級，體質量220～280 g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（甘）2015-0002，使用許可證號：SYXK（甘）2015-0005。

1.2 藥物與試劑 中風康復膏藥物組成：黃精25g，黃芪40 g，當歸60 g，制何首烏30 g，熟地黃20 g，生地黃20 g，豨薟草（酒制）15 g，雞血藤20 g，枸杞子30 g，黨參20 g，白術20 g，吳茱萸25 g，陳皮20 g，佛手20 g。

所有藥材加10倍量水浸泡12 h，應用多功能提取罐提取，按高壓法煎煮2次，1煎150 min，2煎120 min，合并濾液加輔料濃縮，濃縮至每毫升藥液中含生藥7 g（即藥液質量濃度為7 g/mL），經高溫滅菌，在室溫下冷卻，放入冰箱中4℃冷藏備用。

實驗中使用丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號A003-1-1）、一氧化氮合酶（NOS）檢測試劑盒（批號A014-2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒（批號H052-1）、白細胞介素1β（IL-1β）檢測試劑盒（批號H002），均購自南京建成生物工程研究所;細胞間黏附分子（ICAM-1）檢測試劑盒（批號JCL1238）、血管細胞黏附分子（VCAM-1）檢測試劑盒（批號JCL1243），均購自上海晶抗生物工程有限公司;TTC染色液（批號G3003）購自北京索萊寶生物科技公司，MCAO栓線（型號2363-A5，250～280g），購自北京西濃科技有限公司。

1.3 儀器 3K15型低溫高速離心機（上海安亭科學儀器廠）;SCIENTZ-48高通量組織研磨器（寧波新芝生物科技有限公司）;721/721-100型可見分光光度計（上海光學儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 造模 采用改良的Zea-longa等[2]的線栓法制備SD大鼠大腦中動脈缺血-再灌注模型。栓線采用MCAO魚線，長4.5 cm，直徑0.24 mm，一頭頂端為半球形，距頭端18～20 mm處有一黑色標記。大鼠術前12 h禁食，4 h禁水，以7%水合氯醛（7 mL/kg體重）腹腔注射麻醉后，將大鼠頭部及四肢固定于手術臺上，頸部備皮，按外科常規手術用碘伏進行消毒，鋪無菌巾，取頸部正中縱向切口，切口長約2 cm，鈍性分離皮下組織，使用撐開器充分暴露術區視野，解剖、游離右側頸總動脈（CCA），頸內動脈（ICA）及頸外動脈（ECA），避免刺激迷走神經。充分暴露右側ECA約3～5 mm后，用動脈夾夾閉CCA近心端和ICA遠心端，在ECA下放置兩根3-0手術絲線，于距離CCA分叉≥3 mm處雙結扎，用眼科手術剪在兩個線結中間偏遠心端離斷ECA，并在ECA殘端剪一“V”形切口，將MCAO栓線由ECA緩慢插入ICA，打開ICA遠心端動脈夾，緩慢將魚線推送入ICA至大腦中動脈，根據魚線上的黑色標記，推送約18～20 mm，感到有阻力時停止向前推進魚線，將魚線與ECA殘端一起結扎;逐層縫合并將長約0.5 cm魚線遠端曠置、固定。將實驗鼠置于單籠飼養，90min后外拉魚線使其球端回至ECA，進行缺血后再灌注。凡出現動物術中死亡、蛛網膜下腔出血或無梗死灶均為MCAO模型制作失敗，并以相同操作方式隨機補充同批次備用大鼠。對假手術組手術時僅作頸部手術切口，手術分離暴露右側的頸總（CCA）、頸外（ECA）、頸內動脈（ICA），僅離斷頸外動脈及其分支，不做插管。

1.4.2 分組與給藥 將50只體質量220～280 g大鼠飼養于18～22 ℃，明暗各12 h的SPF級動物實驗室內，自由進食飲水喂養1周，采用隨機數字表法將其隨機分為假手術組、模型組、中風康復膏高劑量組（PSR-H組）、中風康復膏中劑量組（PSR-M組）、中風康復膏低劑量組（PSR-L組），共5組。對各組大鼠于術前 （1次/12 h，3 d）及術后（1次/6 h，3 d）灌胃給藥，中風康復膏高、中、低各劑量組按成人與大鼠體表面積比分別給予藥液（質量濃度為 7 g/mL）：8.75 mL/kg、17.5 mL/kg、35 mL/kg灌胃;對假手術組和模型組給予4 mL生理鹽水灌胃。

1.4.3 神經功能評分 采用Zea-Longa's標準評分[5]判斷各組大鼠的神經功能情況。0分為活動正常，無任何神經功能缺損癥狀;1分為提尾時見左側前爪不能充分伸展;2分為提尾時見左側前爪不能充分伸展，向左側轉圈;3分為大鼠行走時向左側旋轉或傾斜;4分為不能自發行走，意識喪失。

1.4.4 腦含水量 測定將各組大鼠麻醉后斷頭、取全腦， 去除小腦和低位腦干后稱重大腦組織，即為腦濕重，110 ℃恒溫烘烤48 h后稱重即為腦干重;根據公式計算腦含水量：腦含水量（%）=（腦濕重-腦干重）/腦濕重×100%。

1.4.5 TTC染色 將全腦置于0.9%氯化鈉溶液中洗滌，并在-20 ℃環境下速凍30 min固定腦組織，從大鼠腦組織冠狀面將大腦切成7片，每片厚約1 mm，將切片放入1%的TTC染色液中，37 ℃避光染色，每15 min輕震蕩數次后取出，用4%多聚甲醛固定并拍照，正常區域為紅色，缺血梗死區域為白色。將照片導入Image J軟件計算腦梗死體積占比，體積=厚度×面積。計算公式為：腦梗死體積占比=（梗死區域體積/整個腦的體積）×100%。

1.4.6 腦組織炎癥因子及氧化應激指標檢測 斷頭處死各組大鼠，快速取腦，分離缺血側腦組織，放于低溫生理鹽水中冰浴，然后用刀片定量切取該側部分腦組織，濾紙吸干血跡，立即凍存于超低溫冰箱（-80 ℃）中。于檢測前制備10%腦組織勻漿并稱重，用眼科手術剪將其剪碎，按照1∶9的比例盡快加入預冷生理鹽水，放入高通量組織研磨器研磨1 min，制成腦組織勻漿，放入高速冷凍離心機，4 ℃，3500 r/min離心15 min，取上清液，測定大鼠缺血側腦組織中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素1β（IL-1β）、細胞間黏附分子（ICAM-1）、血管細胞黏附分子（VCAM-1）、脂質過氧化物丙二醛（MDA）、一氧化氮合酶（NOS）指標，具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 統計學處理 實驗統計數據用標準差（x±s）表示，數據經SPSS 26.0軟件統計處理，采用方差分析，q檢驗，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織含水量及神經功能評分比較 采用稱重法檢測大鼠腦含水量變化，并采用Zea-Longa's標準評分對各組大鼠進行神經功能評分，與假手術組相比，模型組的腦含水量及神經功能評分均顯著升高（P<0.01）。與模型組相比，PSR-H組和PSR-M組大鼠的神經功能評分及腦含水量顯著降低（P<0.01）。詳見表1。

2.2 腦缺血再灌注TTC染色結果 采用 TCC 染色法檢測各組大鼠腦梗死情況，與假手術組相比，模型組大鼠腦組織切片存在明顯白色梗死區，梗死體積百分比顯著升高（P<0.01） 。而PSR給藥干預后，相對于模型組大鼠，腦組織梗死體積百分比均有所降低，其中PSR-H組大鼠腦組織梗死體積百分比減少最為顯著（P<0.01）。詳見表2。各組大鼠腦組織TTC染色切片如圖1所示。

2.3 腦組織炎癥因子表達情況 與假手術組相比，模型組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1的含量均顯著升高（P<0.01）。而PSR給藥干預后，相對于模型組大鼠，其炎癥因子表達量均有所下降，其中PSR-H組大鼠腦組織的炎癥因子表達量下降最為顯著（P<0.01）。詳見表3。

2.4 腦組織氧化應激指標表達情況 與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中氧化應激指標MDA含量和NOS活力明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，PSR給藥組MDA含量和NOS活力均有所下降，其中PSR-H組、PSR-M組大鼠腦組織中MDA含量和NOS活力下降較為明顯（P<0.01） 。詳見表4。

3 討論

臨床研究認為，由于腦缺血再灌注損傷導致的中風患者多是在氣血內虛的根本上，加之勞倦內傷、憂思惱怒、吸煙喝酒等誘因，引起氣血瘀滯，腦脈痹阻[6]。本病的關鍵機制是氣滯、血瘀、絡阻，“氣行則血行”，常以行氣、活血、通絡的方法進行診療 [7]。甘肅中醫藥大學附屬醫院毛忠南主任醫師在治療中風疾病上積累了豐富的經驗，PSR在康復醫學科已應用多年，對于中風恢復期、出血性腦中風恢復期、缺血性腦中風恢復期，臨床觀察療效明顯[3-4]。

中風康復膏中黃精補中益氣、滋腎益肺，制何首烏、枸杞子補益肝腎、益氣養血，生地黃、熟地黃補血生津、益精補腎，豨薟草強健筋骨，黃芪、黨參、雞血藤、岷當歸補益氣血、活血通絡，吳茱萸、佛手、陳皮調理氣機、化痰祛濕，白術補氣健脾。諸藥配伍，共奏補益肝腎、益氣養血、活血化痰之功，可使氣血通暢，精氣充足，從而腦髓得充，痰瘀自消，靈竅得養。研究[8]表明，中風康復膏可增強腦組織對缺血、缺氧的耐受性，能明顯減輕ICS患者認知功能的損害程度，改善患者的日常生活能力，提高患者的生活質量，降低患者病死率和致殘率。

神經功能評分常被用作藥物研究中的一項重要指標，已成為評價藥效的重要依據[9]。本研究采用Zea-Longa's標準評分評價PSR對腦缺血再灌注大鼠神經功能的改善效果。結果顯示，PSR干預后大鼠神經功能評分顯著降低，表明PSR能夠改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能損傷。腦水腫是CIRI的主要并發癥之一，能夠引起顱內壓增高，加重機械性壓迫，損害腦微循環和細胞能量代謝，從而加重腦損害[10]。通過檢測腦含水量能夠有效反映腦缺血再灌注的損傷程度。腦梗死的病灶范圍是對腦缺血再灌注損傷中腦組織損傷程度最直觀的反映，TTC染色后腦梗死體現為明顯白色區域。研究結果表明，模型組大鼠較假手術組腦含水量明顯升高，梗死范圍縮小，不同濃度的PSR干預下，大鼠的腦含水量和腦梗死面積得到不同程度的降低，明顯改善了腦組織缺血再灌注損傷的恢復水平，對腦組織損傷的大鼠具有保護作用。

研究[11-13]表明，炎癥反應是與腦缺血再灌注損傷密切相關的病理途徑，發揮著關鍵作用，腦缺血再灌注損傷發生時，通過釋放TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1等炎癥因子增大血腦屏障通透性，導致腦組織的水腫更加嚴重，進而導致炎癥因子更容易透過血腦屏障，最終加重炎癥反應[14]。TNF-α、IL-1β是重要的炎癥因子，在腦缺血中發揮著重要的作用[15]。同時VCAM-1和ICAM-1在炎癥和腫瘤等病理過程中扮演著重要的角色[16]。研究顯示，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1表達量明顯升高，表明模型組大鼠由于CIRI產生明顯炎癥反應;PSR干預后，大鼠炎癥因子表達量顯著下調，說明PSR可以有效的抑制CIRI炎癥反應。

臨床上發現，缺血性腦卒中病人恢復血流供應后，腦損傷反而加重，即缺血再灌注損傷，氧化應激過程是其不可忽視重要環節，降低氧化應激損傷，可能對腦缺血再灌注損傷的減輕以及下游病理生理反應起到關鍵作用[17]，氧化應激發生后產生大量活性氧發生過氧化反應，其終產物為MDA，同時MDA可影響線粒體呼吸鏈復合物和線粒體內關鍵酶活性，因此MDA可反映機體脂質過氧化程度和細胞氧化損傷程度[18]。在腦缺血再灌注進程中NO可以和超氧陰離子反應形成強氧化劑，使蛋白質硝基化并損傷DNA，而NOS可催化NO生成，因此許多研究中采用NOS活力反映NO含量[19-20]。本研究結果顯示，與模型組比較，PSR給藥組MDA含量和NOS活力均有所下降，其中尤其以PSR中、高劑量組大鼠腦組織中MDA含量和NOS活力下降較為明顯。

綜上所述，研究結果證實，中風康復膏能夠改善MCAO模型大鼠的腦缺血再灌注損傷，相關機制可能與抑制炎癥因子釋放、減少氧化應激損傷有關。本研究只是初步探討了中風康復膏對MCAO模型大鼠的保護作用，其具體分子作用機制仍需要進一步研究。

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（收稿日期：2021-12-10 編輯：劉斌）

基金項目：甘肅省中醫藥管理局項目（GZK-2017-14）。

作者簡介：汪湛東（1993- ），男，漢族，博士研究生在讀，研究方向為骨科外傷及中西醫結合基礎。E-mail： wangzhandong_2020@163.com

通信作者：徐曉艷（1965- ），女，漢族，本科，主任藥師，研究方向為中藥鑒定、中藥炮制、中藥制劑。E-mail： 767204198@qq.com;

王鋼（1967-），男，漢族，本科，主任醫師，研究方向為中西醫結合風濕骨病。E-mail： 1256935844@qq.com