免疫比濁法測定胱抑素C抗原過量研究

王麗霞（英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司生化技術(shù)部　廈門　361022）

免疫比濁法測定胱抑素C抗原過量研究

王麗霞（英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司生化技術(shù)部廈門361022）

摘要：目的：通過對免疫比濁法測定胱抑素C抗原抗體劑量反應(yīng)曲線的研究分析，篩選試劑研制過程中最合適的抗體用量，研制出優(yōu)質(zhì)的試劑，同時準確掌握試劑盒抗原過量的情況，指導(dǎo)臨床應(yīng)用過程中及時對抗原過量的標本進行稀釋，從而確保高濃度臨床標本測定的準確性。方法：通過配制一系列濃度由高到低的抗原溶液，與采用不同抗體用量但各項性能仍符合注冊標準的試劑進行反應(yīng)，記錄反應(yīng)吸光度，繪制抗原抗體劑量反應(yīng)曲線，通過對比不同抗體用量配制的試劑的抗原抗體劑量反應(yīng)曲線達到峰值時的抗原濃度值及吸光度值，結(jié)合儀器吸光度測定量程，確定試劑盒研制過程中抗體的最佳用量。

關(guān)鍵詞：胱抑素C免疫比濁法 抗原抗體

血清半胱氨酸蛋白酶抑制劑C在臨床上通常被稱為胱抑素C（Cystatin C，Cys C），是一種低分子量、堿性非糖蛋白質(zhì)，由120個氨基酸組成，分子量為130KDa。胱抑素C經(jīng)腎小球自由濾過，在近曲小管被重吸收并降解，腎臟是清除循環(huán)中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C的濃度主要有腎小球濾過率（GFR）決定，是一種反映GFR變化的理想內(nèi)源性標志物［1～3］。

Cys C測定方法很多，目前，中國臨床實驗室測定血清胱抑素C的方法主要有兩類，一類是在特種蛋白分析儀上用散射比濁法進行測定，另一種是在全自動生化分析儀上用透射比濁法進行測定。免疫比濁法分析的基本原理是當(dāng)抗原與抗體在稀釋系統(tǒng)中反應(yīng)而比例合適時，形成的免疫復(fù)合物在沉淀促進劑的作用下，于液相中形成微粒，并產(chǎn)生濁度。當(dāng)抗體過量且固定時，溶液中待測抗原的濃度在一定范圍內(nèi)與免疫復(fù)合物的生成量成正比［4］，由此可見，抗原是否過量直接關(guān)系到物質(zhì)測定的準確性。本文對免疫比濁法測定胱抑素C試劑盒在抗原過量方面進行研究，利用劑量反應(yīng)曲線的變化特征，得出試劑抗原過量的情況，從而對試劑盒研制過程中抗體的用量進行指導(dǎo)，開發(fā)出優(yōu)質(zhì)的試劑盒，減少臨床應(yīng)用過程中因抗原過量而造成的測定結(jié)果不準確情況，報道如下。

1材料與方法

1.1抗原、抗體：抗原購自北京百川飛虹生物科技有限公司，抗體購自DAKO公司。

1.2試劑及配套校準品：胱抑素C（Cys-C）測定試劑盒（免疫比濁法）及其配套使用的校準品，由英科新創(chuàng)（廈門）科技有限公司研制，校準品由五個濃度水平，分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/L。

1.3儀器：AU400全自動生化分析儀，日本奧林巴斯公司生產(chǎn)，吸光度測定量程：-2.5～2.5Abs。

1.4方法：免疫透射比濁法，自編測定程序，主要反應(yīng)參數(shù)為樣本6μL，試劑1∶180μL，試劑2∶45μL，測定波長540nm，校準類型：多點校準（spline函數(shù)擬合），反應(yīng)溫度：37℃，反應(yīng)時間：10min，分析模式：兩點終點法，測光點：12～27。

2結(jié)果與討論

2.1抗原抗體反應(yīng)的劑量反應(yīng)曲線分析：采用高濃度的抗原配制一系列Cys C濃度值為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0、24.0、26.0、28.0、30.0mg/L的溶液；因免疫比濁法試劑工藝過程復(fù)雜，抗體量加入過多易造成凝集，抗體量過少無法達到試劑靈敏度及線性范圍的要求，在試劑研制過程中，在符合試劑注冊標準要求且不產(chǎn)生凝集的限度下采用不同抗體用量配制Cys-C試劑，并與上述配制的一系列抗原溶液進行反應(yīng)，測定反應(yīng)吸光度；以Cys C濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制劑量反應(yīng)曲線，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，免疫比濁法測定Cys C的劑量反應(yīng)曲線是一條雙相反應(yīng)曲線，在恒定劑量的抗體溶液中加入不同劑量的抗原時，反應(yīng)吸光度起初隨著抗原劑量的增加而逐步增加，當(dāng)達到峰值后，反應(yīng)吸光度隨著抗原劑量的進一步增加反應(yīng)降低，而達到峰值的抗原濃度主要取決于試劑中抗體的用量以及測定儀器的吸光度量程范圍。抗原抗體反應(yīng)這一獨特的現(xiàn)象就是眾所周知的鉤狀效應(yīng)［5］，可以用“Heidel berger曲線”來描述［6］，曲線左側(cè)為抗體過剩的測定區(qū)，稱為前帯，中間為抗體抗原濃度大致相等的等當(dāng)量區(qū)，稱為等價帶，右側(cè)為抗原過量區(qū)，為后帶。因此，高劑量抗原使強陽性的標本誤測為弱陽性，甚至假陰性結(jié)果［6］，嚴重影響臨床標本測定結(jié)果的準確性。研究抗原抗體反應(yīng)體系中抗原過量狀態(tài)是免疫比濁法試劑開發(fā)及臨床應(yīng)用中必須重視的問題。

2.2不同抗體用量配制CysC試劑抗原過量分析：從圖1中可以得出，當(dāng)抗體用量為50mg/L時，劑量反應(yīng)曲線達到峰值時的抗原濃度為12mg/L，而隨著抗體用量的增加，劑量反應(yīng)曲線達到峰值的抗原濃度值逐漸升高，當(dāng)抗體濃度為100mg/L和120mg/L時，達到吸光度峰值的抗原濃度值相同，均為22mg/L，但當(dāng)繼續(xù)增加抗體的用量至150mg/L時，劑量反應(yīng)曲線達到峰值時的抗原濃度值反而下降為18mg/L，這是因為此時反應(yīng)吸光度達到了2.5Abs.，已超出了生化分析儀吸光度測定量程的上限，儀器無法準確測定；各抗體用量所配制試劑抗原過量情況見表1。

表1不同抗體用量配制試劑抗原抗體劑量反應(yīng)曲線峰值處抗原濃度及反應(yīng)吸光度

2.3 CysC試劑抗體用量的確定：從以上實驗結(jié)果可以得出，當(dāng)抗體濃度為100mg/L和120mg/L時，劑量反應(yīng)曲線達到峰值時的抗原濃度值相同，但在抗體濃度為120mg/L時，峰值處的吸光度值過高，超出了生化分析儀的吸光度測定量程，測定結(jié)果準確度無法保證，部分型號的儀器還會出現(xiàn)吸光度超限的報警而無法給出結(jié)果；綜合試劑各項性能指標，該產(chǎn)品的線性范圍為0～8mg/L，健康成人血清胱抑素C的參考區(qū)間在0.59～1.03mg/L［4］，臨床上腎病患者的血清胱抑素C濃度水平在22mg/L以上的幾乎不可見，當(dāng)試劑盒的抗體用量為100mg/L可滿足臨床需求，因此本研究最后確定試劑中胱抑素C的抗體用量為100mg/L。

3結(jié)論

免疫比濁類試劑在研制開發(fā)過程中，在滿足產(chǎn)品注冊標準的同時還應(yīng)充分進行抗原過量研究，根據(jù)研究結(jié)果加入足量抗體，為臨床提供優(yōu)質(zhì)試劑；同時通過對所研制試劑抗原抗體劑量反應(yīng)曲線的分析，精確掌握試劑出現(xiàn)抗原過量的濃度值，在臨床應(yīng)用過程中給予客戶正確的指導(dǎo)，從而盡可能避免因高濃度標本測定結(jié)果的不準確而造成誤診。

參考文獻

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［3］Delanaye P，Nellessen E，Cavalier E，et al．Is cystatin C useful for the detection and the estimation of low glomerular filtration ratein heart transplant patients［J］．Transplantation，2007，83（5）：641-644．

［4］尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規(guī)程（第4版）［M］.人民衛(wèi)生出版社，2015：311.

［5］滕曉梅.免疫比濁法用于全自動生化分析儀中產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)的防范［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36（12）：1649-1650.

［6］彭鳳.免疫透射比濁測定技術(shù)的進展和分析特性［J］.檢驗醫(yī)學(xué)，2012，27（4）：252-255.

中圖分類號：R446.1

文獻標識碼：A

文章編號：1672-8351（2016）07-0013-02