蒲公英甾醇治療大鼠膝關節骨關節炎的作用機制初步探索

謝子康，史銘鈺，蔣陽，王斌，沈鵬飛，鄭沖，楊曉峰

(常州市中醫醫院骨一科，江蘇 常州 213000)

膝關節骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以關節軟骨及關節周圍組織慢性、退行性改變的疾病。有研究發現，在骨關節炎的發生及發展過程中，炎性因子亦扮演著重要角色，即炎性介質的過度表達伴隨著組織的逐漸退化[1]。蒲公英是菊科植物蒲公英的干燥全草，現代藥理研究表明，蒲公英還具有抗氧化、抗菌、抗炎等多種作用[2]；蒲公英甾醇是蒲公英的主要有效成分之一；動物及細胞試驗顯示，蒲公英甾醇可抑制白細胞介素(interleukin，IL)-1β誘導的類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞的炎癥和類風濕關節炎的進展，其作用機制可能包括抑制炎性因子水平、抑制基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、調控TLR4/NF-κB信號通路等[3-4]；因此，蒲公英甾醇的抗炎、抗氧化作用亦有望應用于骨關節炎的治療中。然而，目前國內外研究尚無針對蒲公英甾醇治療KOA的探討，為彌補這一空白，此次研究擬通過動物試驗對蒲公英甾醇治療KOA大鼠的作用機制進行初步了解，從而為后續研究提供參考依據，也為KOA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康4周齡SD雄性大鼠50只，每只大鼠重量240～260 g。由常州卡文斯實驗動物有限公司提供，動物合格證號SCXK(蘇)2019-0004。

1.2 試藥與儀器 蒲公英甾醇由成都瑞芬思生物科技有限公司提供(CAS：1059-14-9)；木瓜蛋白酶、半胱氨酸由江蘇佰耀生物科技有限公司提供；酶聯免疫吸附試驗試劑盒由北京博奧派克生物科技有限公司提供；全自動蛋白質印跡定量分析系統由晶檀生物科技(上海)有限公司提供；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)儀由美國 Bio-rad iCycler iQ 伯樂公司提供，各種聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)抗體、試劑盒、引物均由寶日醫生物技術(北京)有限公司提供；酶標儀由上海賽默科技生物發展有限公司提供；-80℃超低溫冰箱MDF-C8V由SANYO三洋電機提供；光學顯微鏡由日本奧林巴斯提供；臺式高速冷凍離心機H2050R由湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司提供。

1.3 KOA大鼠模型的建立及分組給藥方式 參照文獻[5]方案建立KOA大鼠模型：大鼠稱重后置于實驗操作臺上，按3 mL/kg劑量給予腹腔注射水合氯醛麻醉，無菌條件下行大鼠左側膝關節腔穿刺，自髕骨外下方進針，確定進入關節腔后向關節腔內注射0.2 mL濃度預制好的4%木瓜蛋白酶溶液+0.03 mmol/L半胱氨酸混合液，隔日注射1次，持續2周。每日定時驅趕強迫大鼠活動30 min，增加其活動量以促進骨關節炎模型建立；每日觀察大鼠肢體活動情況及關節有無感染、腫脹等。假手術組造模術中左側膝關節腔穿刺后注射生理鹽水0.2 mL，其余操作與前述相同。研究組建模成功后，分為低劑量組、中劑量組、高劑量組、模型組、假手術組，各10只；每日上午9～10時分別給予蒲公英甾醇2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg及生理鹽水灌胃，每日1次，持續4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 血清生化指標的檢測 抽取各組大鼠心尖處血液樣本，2 000 r/min的條件下離心15 min，獲取血清；采用酶聯免疫吸附法測定血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine aspartic acid protease，Capase-1)水平。

1.4.2 RT-qPCR法測定關節軟骨組織中微小RNA(microRNA，miRNA)-140、miRNA-146a表達水平 用頸椎脫位法處死全部大鼠，打開每只大鼠左膝關節腔，取左膝關節軟骨組織，用Trizol試劑提取總RNA，用Prime Script RT試劑盒將每個樣本的2 μg總RNA反轉錄為cDNA。反轉錄條件：37℃條件下15 min，5℃條件下5 s，4℃條件下30 min。以β-actin為內參。引物序列見表1。

表1 引物序列表

1.4.3 Western blot法測定關節軟骨組織中相關蛋白表達水平 采用 Western blot法測定關節軟骨組織中核因子κB抑制因子(inhibitor of NF-κB，IκB)、IκB激酶β(inhibitor κB kinase β，IKKβ)、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、轉化生長因子β活化激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)、NOD樣受體家族3(NOD-like receptors 3，NLRP3)、凋亡相關微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)的表達水平。取各組大鼠左膝關節軟骨組織，加入緩沖液提取蛋白，濕式電泳儀轉膜300 mA、60 min；5%脫脂牛奶室溫下封閉 1 h；Ⅰ抗和內參照抗體 4 ℃孵育16 h；加入稀釋好的二抗(抗兔 IgG)，在室溫下孵育1 h，使用電化學發光顯影，并使用ChemiDoc XRS(BioRad)顯色，lphaEase FC軟件取值，分析目標帶與內參帶的灰度值比值。

1.4.4 關節軟骨組織的病理觀察 制備各組大鼠膝關節軟骨組織石蠟切片，充分剝離皮膚肌肉之后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，10%稀鹽酸脫鈣2～4 d，梯度脫水后石蠟包埋，行額狀面切片(沿膝關節矢狀面將脛骨內側平臺軟骨下松質骨和股骨內側髁軟骨下松質骨沿下肢縱軸方向切片，厚度約5 mm)、HE染色，常規脫水、透明、封片處理。參照Mankin法行軟骨組織評分，包括結構(0～6分)、細胞(0～3分)、基質染色(0～4分)、潮線完整性(0～1分)4個部分；總評分為各部分評分之和(0～14分)，評分越高表示關節軟骨組織性質越差。

2 結 果

2.1 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平均明顯高于假手術組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表2)。

表2 5組血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MMP-1、MMP-3、Capase-1水平的比較

2.2 5組關節軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關節軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達水平均明顯低于假手術組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關節軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達水平均明顯高于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯高于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯高于低劑量組(P<0.05，見表3)。

2.3 5組關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平的比較 高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平均明顯高于假手術組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表4、圖1)。

表3 5組關節軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達水平的比較

表4 5組關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平的比較

圖1 5組關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達的Western blot法檢測圖

a 假手術組 b 模型組

c 低劑量組 d 中劑量組

e 高劑量組

2.4 5組關節軟骨組織病理情況的比較 KOA大鼠關節軟骨組織病理情況：假手術組關節軟骨表面平整光滑，無裂縫或缺損，軟骨細胞形態正常、排列整齊，潮線完整，軟骨基質染色均勻；模型組關節軟骨表面不平整，有缺損及裂縫，節軟骨細胞形態異常、排列紊亂，潮線缺損，軟骨基質染色不均勻；低劑量組：關節軟骨表面比較光滑，軟骨細胞形態異常，排列紊亂，潮線缺損，軟骨基質染色不均勻；中劑量組與高劑量組關節軟骨表面平整，軟骨細胞排列較為整齊，潮線基本完整，關節軟骨染色均勻(見圖2)。

高劑量組、中劑量組、低劑量組及模型組的關節軟骨組織Mankin評分均明顯高于假手術組(P<0.05)，高劑量組、中劑量組及低劑量組的關節軟骨組織Mankin評分均明顯低于模型組(P<0.05)，高劑量組均明顯低于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，中劑量組均明顯低于低劑量組(P<0.05，見表5)。

表5 5組關節軟骨組織Mankin評分的比較分)

3 討 論

3.1 蒲公英甾醇對KOA大鼠炎性細胞因子的影響 KOA的發病機制比較復雜，KOA的關節軟骨及周圍骨質會發生病理性改變，在關節軟骨的破壞過程中會產生大量的基質降解產物及炎癥介質，炎癥(特別是滑膜炎癥)在KOA的發生及發展中扮演著重要角色[6]。TNF-α與IL-6能促進關節軟骨細胞外基質蛋白發生降解，加速關節軟骨的破壞；IL-6基因敲除可導致小鼠發生KOA，提示IL-6是KOA關節軟骨破壞的關鍵炎癥介質[7]。MMP是一類結構相似的蛋白酶，可誘導關節軟骨發生降解，引起膠原纖維變薄，加速膠原成分的裂解，膠原排列出現松散，造成軟骨基質發生腫脹，促進關節軟骨發生變性，從而導致KOA[8]。IL-1β是一種強效促炎細胞因子，能誘導關節軟骨細胞和滑膜細胞合成MMP，在KOA關節軟骨的退變過程中發揮著重要作用[9]。Caspase-1是IL-1β的轉化酶，能對IL-1β前體進行加工，成為IL-1β活性形式，是對IL-1β進行激活的重要環節，Caspase-1在KOA動物模型關節軟骨組織中高表達[10]。本研究中，與假手術組比較，藥物組與模型組的以上各項炎性因子水平均明顯增高，進一步說明了KOA的發生及發展與炎性因子存在密切關系；而與模型組比較，KOA大鼠蒲公英甾醇灌胃4周后以上各項炎性因子水平均明顯降低，隨著給藥劑量的增加而明顯降低，提示蒲公英甾醇能夠降低KOA大鼠的血清炎性因子水平，且呈劑量依賴性。

3.2 蒲公英甾醇對KOA大鼠關節軟骨組織中miRNA-140、miRNA-146a表達水平的影響 KOA的發生及發展受到表觀遺傳調控的影響，miRNA是KOA基因調節的關鍵因子。有研究[11]顯示，9種miRNA在KOA關節軟骨組織中的表達水平上調，7種miRNA的表達水平下調。miRNA-140、miRNA-146a主要在軟骨組織中表達，在關節軟骨的生長發育、穩態維持及損傷修復中發揮著重要作用[12]。在大鼠胚胎骨發育過程中，miRNA-140在軟骨組織中的表達水平特異性增高；miRNA-140對蛋白聚糖酶-5的表達具有調控作用，對大鼠miRNA-140基因進行敲除后發現，增齡性KOA關節軟骨退變的發生率增高，而關節軟骨組織中miR-140的高表達對手術誘發的KOA具有對抗作用[13-14]。以往研究[15]顯示，miRNA-146a能對蛋白聚糖酶及MMP在軟骨組織中的表達進行抑制，可能與NF-κB等信號通路活化受阻有關；miRNA-146a能對MMP-13及胰島素樣生長因子結合蛋白-5的合成進行間接調控，參與膝關節內穩態的維持。臨床研究[16-17]顯示，相對于非KOA患者，KOA患者關節滑液中miRNA-140、miRNA-146a的表達水平明顯降低。本研究中，與假手術組比較，藥物組與模型組的miRNA-140、miRNA-146a表達水平均明顯降低，提示當miRNA-140、miRNA-146a高表達時，KOA關節軟骨退變得到抑制，即miRNA-140、miRNA-146a是KOA的保護因素；蒲公英甾醇治療4周后miRNA-140、miRNA-146a的表達水平明顯高于模型組，隨著給藥劑量增加而明顯增高，分析原因可能是蒲公英甾醇治療后TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子水平降低，滑膜細胞凋亡減少，miRNA-140、miRNA-146a的降解減少。

3.3 蒲公英甾醇對KOA大鼠關節軟骨組織中IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平的影響 KOA的發生及發展中存在炎性細胞因子、蛋白與信號通路的相互調控，能導致關節軟骨細胞的合成-分解代謝發生紊亂，導致關節軟骨結構功能發生改變[18]。NF-κB蛋白家族可以選擇性的結合在B細胞κ-輕鏈增強子上調控許多基因的表達；動物及細胞實驗[19-20]均表明，NF-κB信號通路在KOA中被過度激活；NF-κB對Ⅱ型膠原的表達起到抑制作用，對TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的表達起到促進作用，從而促進炎性反應的發生；NF-κB還能對NO的產生起到調節作用，促進軟骨細胞的凋亡，而對NF-κB信號通路的病理性激活進行抑制，能促進KOA關節軟骨病變的修復。IκB是NF-κB的抑制蛋白，IKKβ是IκB激酶的一種亞單位，IκB與IKKβ在NF-κB信號通路的激活過程中起到支柱性作用；NF-κB信號通路通過促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)或細胞膜受體級聯激活，導致NF-kB誘導激酶(NF-kB-inducing kinase，NIK)激活，進而活化IKKβ，磷酸化IκB，最終導致KOA軟骨組織降解及發生關節損傷[21]。TAK1是促分裂原活化蛋白-3kinase(mitogen-activated protein-3 kinase，MAP3K)家族的成員之一，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號通路與NF-κB信號通路上游的重要激酶，能被多種促炎性細胞因子激活[22]；臨床研究[23]顯示，骨關節炎患者軟骨組織中的TAK1的表達水平明顯上調，對TAK1基因及蛋白的表達進行抑制，能降低下游炎性因子及MMP等相關蛋白酶的表達。NLRP3炎性小體含有ASC、Caspase蛋白酶，能調節Caspase-1的活化，促進前體pro-IL-1β、pro-TNF-α等炎性細胞因子的成熟和分泌，誘導細胞炎性反應[24]；以往研究[25]顯示，NLRP3在兔KOA模型軟骨細胞中的表達水平顯著增高；體外細胞實驗結果顯示TNF-α可以促進類風濕關節炎患者成纖維樣滑膜細胞中NLRP3的蛋白表達[26]；臨床研究[27]顯示類風濕關節炎患者外周血單個核細胞中NLRP3、ASC mRNA相對表達量顯著升高。本研究中，與假手術組比較，藥物組與模型組的IκB、IKKβ、NF-κB、TAK1、NLRP3、ASC蛋白表達水平均明顯增高，提示TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路過度激活是KOA的發生及發展的機制之一；蒲公英甾醇治療4周后的以上指標的蛋白表達水平明顯低于模型組，隨著給藥劑量的增加而明顯降低，提示對TAK1/NF-Κb、NLRP3信號通路病理性激活進行抑制是蒲公英甾醇治療KOA大鼠的作用機制，且呈劑量依賴性。同時本研究還觀察到蒲公英甾醇能明顯減輕KOA大鼠關節軟骨組織的Mankin評分，隨著給藥劑量的增加，效果明顯增加，原因是蒲公英甾醇抑制了KOA大鼠的炎性反應。

3.4 小結 蒲公英甾醇對大鼠KOA具有保護作用，能減輕關節軟骨組織的病理學改變，且呈劑量依賴性，炎癥抑制、miRNA表達上調及TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路活化受阻可能是其作用機制。下一步將對炎性細胞因子、miRNA及相關信號通路之間的關系，TAK1/NF-κB、NLRP3信號通路上下游的傳導機制等進行深入研究，為蒲公英甾醇治療KOA的新藥開發及臨床治療提供堅實的基礎。