癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中海馬神經元損傷情況和可能機制

孫桂好 劉建民 孫友祿 陳正紅 鄭利敏

262100 安丘市人民醫(yī)院神經外科1，山東 安丘

250000 山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院神經外科2，山東 濟南

257300 廣饒縣人民醫(yī)院神經外科3，山東 東營

276499 臨沂市中心醫(yī)院心電圖室4，山東 臨沂

271000 泰安市中心醫(yī)院神經外科5，山東 泰安

癲癇持續(xù)狀態(tài)被氯化鋰-毛果蕓香堿誘發(fā)后會引發(fā)幾個腦區(qū)神經元的嚴重病變，其中最為顯著的為海馬區(qū)損傷[1]。本研究探討癲癇持續(xù)狀態(tài)模型中海馬神經元損傷情況和可能機制，現(xiàn)報告如下。

資料與方法

購買山東大學實驗動物中心提供的12 只健康雄性Wistar 大鼠，體重200～240 g，飼養(yǎng)溫度23～25℃，讓其自由飲食、進水。

方法：①試劑與儀器：購買美國Sigma-Aldrich公司生產的氯化鋰，瑞士Roche 公司生產的In Situ Cell Death Detection Kit(POD)原位凋亡檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司生產的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，上海博生物試劑公司生產的蛋白酶抑制劑混合物，美國Santa Cruz 公司生產的Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose。②動物分組與大鼠模型制備：隨機分為實驗組、對照組，每組6只。實驗組對癲癇發(fā)作進行誘導途徑為給予Wistar 大鼠腹腔注射氯化鋰127mg/kg，18～24h后給予其腹腔注射毛果蕓香堿30mg/kg，注射毛果蕓香堿前30 min給予大鼠腹腔注射硫酸安托品1 mg/kg，出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)后1～1.5 h給予大鼠腹腔注射地西泮10 mg/kg將抽搐解除。依據(jù)Racine分級標準評價癇性發(fā)作行為學，正常行為狀態(tài)評定為0級；面部肌肉在立須、眨眼、咀嚼等情況下抽搐，顫動呈“濕狗樣”評定為1級；頸部肌肉抽搐，主要表現(xiàn)為點頭運動評定為2級；前肢抽搐、陣攣評定為3級；雙側前肢伸直伴身體立起評定為4級；跌倒并全身驚厥評定為5級[2]。復雜部分發(fā)作：1級+2級+3級；全身強直陣攣發(fā)作：4級+5級，指成功誘發(fā)。對照組：給予Wistar大鼠腹腔注射等劑量氯化鋰+生理鹽水。③灌注取材：分批處死兩組大鼠，然后用水合氯醛100 mg/L對大鼠進行麻醉后進行心臟灌流、固定、脫水、透明、石蠟包埋，用石蠟切片機連續(xù)冠狀切片，厚度為5 μm。對海馬CA1、CA3區(qū)形態(tài)學變化、凋亡情況進行觀察，途徑為TUNEL染色、Nissl染色。

觀察指標：①海馬形態(tài)學變化。②海馬神經元凋亡情況。③不同時間點Glu R2蛋白表達。

研究方法：①觀察海馬形態(tài)學變化。石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，孵育10 min，位置為在37℃水浴箱中，然后分化到背景無色，在此過程中分別將乙醇950 mL/L、硫堇5 mL/L充分利用起來，常規(guī)脫水、透明、封片。將1個切片從每隔5張中取出來，共將3張取出來Nissl 染色。在顯微鏡(×400)下對CA1、CA3 區(qū)100 μm×100 μm 區(qū)域神經元數(shù)量進行計數(shù)[3]。②海馬神經元凋亡情況。TUNEL 染色，應用原位凋亡檢測試劑盒，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，將內源性過氧化物酶浸洗去除，在此過程中將過氧化氫(H2O2)30 mL/L充分利用起來。室溫濕盒中對其進行通透，在此過程中將蛋白酶K 充分利用起來。在37℃的溫度下對TUNEL 1 號、2 號混合液進行反應1 h，用PBS 代替1號液作為陰性對照組。PBS 清洗后將TUNEL 3 號液50 μL 加入，孵育30 min，位置為在37℃濕盒中。PBS清洗后將DAB加入顯色，復染過程中將蘇木精充分利用起來。常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。將鄰近Nissl 染色的腦片利用起來，陽性細胞指有棕黃色顆粒出現(xiàn)在胞核中。光鏡下對染色結果進行分析，每組將陽性細胞最明顯的3 個×400 高倍視野從CA1、CA3區(qū)選取出來，將每個高倍視野下的陽性細胞數(shù)計算出來[4]。③不同時間點Glu R2 蛋白表達。Western blot 測定，冰上以較快的速度將海馬取出來，用上海碧云天生物技術有限公司生產的RIPA 細胞組織快速裂解液將總蛋白提取出來，對蛋白濃度進行測定。每組用十二烷基磺酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺對蛋白20 μg左右進行凝膠電泳，向聚偏二氟乙烯膜轉入，TBST室溫下封閉脫脂奶粉(50 g/L)70 min，將北京中杉金橋生物技術有限公司生產的1∶500 小鼠β-action 抗體、美國Chemicon 公司生產的1∶800 兔Glu R2 抗體加入，室溫下孵育30 min，在4℃的溫度下過夜，室溫下孵育辣根過氧化物酶耦聯(lián)第二抗體70 min。采用美國LI-COR 公司生產的C-DiGit 化學發(fā)光掃描儀顯影，運用電化學發(fā)光法對灰度值進行測定。將內參設定為β-action，蛋白相對表達量=目的蛋白/內參蛋白灰度值[5]。④癲癇持續(xù)3 d 后Glu R2/GAPDH 耦合現(xiàn)象。免疫共沉淀、Western blot 技術檢測，冰上以較快的速度將海馬取出來，100∶1 混合蛋白酶抑制劑混合物和Western blot 及免疫沉淀細胞裂解液蛋白進行裂解，對蛋白濃度進行測定時運用BCA 法。采用Normal rabbit IgG+Protein A/G plus agarose 將非特異結合蛋白去除。在Normal rabbit IgG、兔Glu R2 抗體中分別加入蛋白500～600 μg，在4℃的溫度下孵育過夜。在4℃的溫度下孵育Protein A/G plus agarose 1 h，離心30 s，速率為10 000 r/min，將上清棄去。將1×SDS 上樣緩沖液30 μL加入沉淀中，煮沸變性，進行Western blot步驟，比較實驗組和對照組中GAPDH 和Glu R2 灰度值，將GAPDH/Glu R2的耦合變化獲取過來[6]。

統(tǒng)計學分析：使用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用(±s)表示，比較采用F檢驗，重復測量的計量資料進行方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

兩組大鼠的海馬形態(tài)學變化比較：實驗組大鼠持續(xù)6 h、1 d、3 d、7 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞數(shù)均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，持續(xù)6 h、1 d、3 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞數(shù)均逐漸減少(P＜0.05)，但持續(xù)6 h和7 d的海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞數(shù)比較(±s，個/HP)

表1 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)神經元細胞數(shù)比較(±s，個/HP)

組別 n 持續(xù)時間 CA1區(qū) CA3區(qū)實驗組 6 6 h 31.00±2.00 38.32±3.05 1 d 24.00±1.72 34.66±3.50 3 d 13.66±2.03 25.66±2.07 7 d 32.32±3.50 34.66±3.50對照組 6 44.32±5.12 52.32±4.50 F 4.541 4.303 P＜0.05 ＜0.05

兩組大鼠的海馬神經元凋亡情況比較：實驗組大鼠持續(xù)6 h、1 d、3 d、7 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細胞數(shù)均多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，持續(xù)6 h、1 d、7 d、3 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細胞數(shù)均逐漸增多(P＜0.05)，但持續(xù)1 d 和7 d 的海馬CA1、CA3 區(qū)凋亡細胞數(shù)之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表2。

表2 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)凋亡細胞數(shù)比較(±s，個/HP)

表2 兩組大鼠的海馬CA1、CA3區(qū)凋亡細胞數(shù)比較(±s，個/HP)

組別 n 持續(xù)時間 CA1區(qū) CA3區(qū)實驗組 6 6 h 6.32±1.51 12.00±2.00 1 d 20.00±3.60 17.32±1.52 3 d 44.00±4.57 36.66±4.50 7 d 20.66±3.20 18.66±2.07對照組 6 2.00±0.06 5.66±1.52 F 6.965 3.365 P＜0.05 ＜0.05

兩組大鼠的海馬Glu R2 蛋白表達比較：實驗組大鼠持續(xù)1 d、7 d 的海馬Glu R2蛋白表達均多于持續(xù)3 d，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，持續(xù)1 h、6 h的海馬Glu R2蛋白表達和對照組之間的差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，持續(xù)1 d、3 d、7 d的海馬Glu R2蛋白表達均少于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 不同時間點Glu R2 蛋白表達

兩組大鼠的癲癇持續(xù)3 d 后海馬Glu R2/GAPDH耦合現(xiàn)象比較：實驗組大鼠持續(xù)3 d 的海馬Glu R2/GAPDH 蛋白復合物耦合程度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見圖2。

圖2 大鼠海馬裂解液中的甘油醛-3-磷酸脫氫酶

討 論

本研究結果和相關醫(yī)學研究結果一致[7-8]，說明癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型中的神經元損傷為谷氨酸具有較多的釋放，通過Glu R2/GAPDH 耦合在AMPAR 上作用，進而引發(fā)興奮性神經毒性，可能和腦缺血模型中的神經元變化類似。

綜上所述，癲癇持續(xù)狀態(tài)會損傷海馬神經元，可能機制為Glu R2 表達下降、Glu R2/GAPDH 蛋白復合物耦合增加。