雪茄煙葉（BESNO H382）不同組織器官及鹽脅迫條件下內(nèi)參基因的篩選

張 慧，金靜靜，徐國(guó)云，翟 妞，鄭慶霞，劉萍萍，陳千思，金立鋒，周會(huì)娜

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

雪茄煙葉按照其用途可以分為三類：茄衣、茄套和茄芯［1］。優(yōu)良品種的缺乏和現(xiàn)有品種的退化已成為我國(guó)茄衣煙葉生產(chǎn)上的主要問(wèn)題［2］。目前在茄衣煙葉的栽培和調(diào)制方面研究較多［3-5］，但對(duì)于茄衣煙葉的分子生物學(xué)及遺傳育種方面的研究則十分匱乏。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，利用二代測(cè)序和三代測(cè)序相結(jié)合的方法獲取雪茄煙葉（茄衣）基因組的序列及表達(dá)數(shù)據(jù)，進(jìn)而挖掘基因功能，創(chuàng)制出雪茄煙葉優(yōu)良性狀的育種材料成為可能［6-8］。

基因表達(dá)分析是分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)研究?jī)?nèi)容，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是基因表達(dá)分析的重要技術(shù)手段［9-10］，常用來(lái)檢測(cè)不同組織、不同試驗(yàn)條件下特定基因的表達(dá)情況或者驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。選擇合適的內(nèi)參基因是保證qRT-PCR分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提［11］。常用的內(nèi)參基因包括ACTIN（肌動(dòng)蛋白家族基因）、RPL（Ribosomal protein L，核糖體蛋白基因）、UBQ（ubiquitin，多 聚 泛 素 酶 基 因）、EF-1 α（Elongation factors 1 alpha，轉(zhuǎn)錄延伸因子基因）、GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因）、TUB（tubulin，β微管蛋白基因）［12-14］等。盡管這些基因高度保守，但在不同植物及組織中、不同生理狀態(tài)條件下的表達(dá)量并不穩(wěn)定，因此研究者需要根據(jù)具體的物種和不同的處理?xiàng)l件選擇合適的內(nèi)參基因［15-16］，如藜麥中選擇肌動(dòng)蛋白（ACT-1）和微管蛋白（TUB-6）作為鹽脅迫下的內(nèi)參基因等。

關(guān)于普通栽培煙草的內(nèi)參基因，最早Schmidt等［17］研究挑選了L25 和EF-1α兩個(gè)基因。王燃等［13］基于煙草芯片數(shù)據(jù)篩選獲得了HSC70-1基因作為內(nèi)參。由于烤煙與晾曬煙的遺傳相似性差異較大［18］，因此普通栽培煙草（烤煙）的內(nèi)參基因是否適用于雪茄煙葉（晾曬煙）尚不明確。基于前期對(duì)雪茄煙葉的三代測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析，已經(jīng)得到了較為完整的雪茄煙葉基因信息［19］。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉中未找到完整的L25 基因序列，這可能與測(cè)序及拼接有關(guān)；而EF-1α基因根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)判斷在根莖葉中的表達(dá)量較低且并不一致。此外，目前已報(bào)道的栽培煙草L25 和EF-1α的qPCR 引物在雪茄煙葉里特異性差，因此不適合作為雪茄煙葉的內(nèi)參基因。結(jié)合雪茄煙葉的三代測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，從中篩選各組織較高表達(dá)且表達(dá)量一致的10 個(gè)基因作為候選內(nèi)參基因。利用qRT-PCR 獲得這10個(gè)基因在雪茄煙葉不同組織器官以及鹽處理前后雪茄煙葉葉片中的表達(dá)量，并使用geNorm［20］、NormFinder［21］和BestKeeper［22-23］等3 個(gè)軟件對(duì)候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，旨在篩選出適合用于雪茄煙葉不同組織器官和鹽脅迫條件下基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

雪茄煙葉（品種BESNO H382）種植在國(guó)家煙草基因研究中心的植物生長(zhǎng)室中（培養(yǎng)條件：溫度28 ℃，相對(duì)濕度70%～75%，光照16 h，黑暗8 h）。雪茄煙葉不同組織器官（旺長(zhǎng)期根、莖、葉，盛花期花萼、花冠、柱頭、子房、雄蕊、雌蕊及種子）取樣后，于液氮中迅速冷凍后保存在-80 ℃超低溫冰箱中。鹽脅迫試驗(yàn)：待煙苗長(zhǎng)至6片真葉時(shí)，移至1/2 MS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，1周后向培養(yǎng)液中加入300 mmol/L的NaCl溶液處理0 h、3 h、1 d、3 d和7 d，選取同一葉位的葉片進(jìn)行取樣，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ袠悠肪O(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成方法具體為：將采集的樣品在液氮中充分研磨，根據(jù)植物RNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］說(shuō)明書(shū)提取總RNA。通過(guò)Nano Drop 2000［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］檢測(cè)RNA的濃度和純度（A260/A280=1.8～2.1，A260/A230＞1.8），并通過(guò)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的質(zhì)量和完整性。檢測(cè)合格的總RNA 用于cDNA 第一鏈的合成，具體步驟參照Roche 第一鏈cDNA 合成試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)。合成的cDNA按1∶5稀釋后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 候選內(nèi)參基因的篩選及qRT-PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期已完成的雪茄煙葉三代測(cè)序及根莖葉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)［19］，篩選在不同組織表達(dá)量接近且高表達(dá)的持家基因，從中選取10個(gè)文獻(xiàn)報(bào)道的常用內(nèi)參基因作為本研究中的候選內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)特異性引物（表1），并將設(shè)計(jì)好的引物提交至北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

表1 候選內(nèi)參基因qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers for candidate reference genes

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及引物擴(kuò)增效率的計(jì)算

用Roche Light Cycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)體系20 μL：10 μL 2×SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，cDNA 模板1 μL，加ddH2O 至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45 個(gè)循環(huán)；60 ℃～95 ℃持續(xù)15 s 作為熔解曲線分析程序。脯氨酸合成酶基因（P5CS）的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCT方法計(jì)算，其中P5CS 基因的定量引物為：上游5′-CTGCAAGAGAATGCGCCAG-3′ ，下游5′-GCCAGGATTTCCTCTTCATT-3′ 。參考文獻(xiàn)［24］計(jì)算引物擴(kuò)增效率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Prism6 軟件繪制10 個(gè)候選基因在所有樣品中CT值的分布箱線圖。利用geNorm、NormFinder和Bestkeeper 軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA質(zhì)量檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，RNA 條帶清晰，無(wú)彌散現(xiàn)象；經(jīng)過(guò)Nano drop 2000 的檢測(cè)，所 有 樣 本A260/A280介 于1.8～2.1 之 間，A260/A230介 于1.8～2.2 之間。說(shuō)明RNA 完整性好，純度高，且沒(méi)有降解。證明RNA樣品純度較高，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 雪茄煙葉不同組織器官中提取的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different tissues and organs of cigar tobacco

2.2 候選內(nèi)參基因擴(kuò)增特異性分析及擴(kuò)增效率

將雪茄煙葉不同組織的總RNA 分別反轉(zhuǎn)錄成cDNA 進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)，結(jié)果（圖2）表明，10 個(gè)候選內(nèi)參基因的熔解曲線均呈現(xiàn)顯著的單一峰，沒(méi)有引物二聚體及非特異擴(kuò)增的情況出現(xiàn)，可用于內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析。同時(shí)，10 個(gè)候選基因的擴(kuò)增效率介于91.74%～107.1%之間（表2），R2較高（均在0.980 0 以上），滿足qRT-PCR 對(duì)引物擴(kuò)增效率的要求，可用于進(jìn)一步分析。

表2 雪茄煙葉候選內(nèi)參基因擴(kuò)增效率比較Tab.2 Amplification efficiency of candidate reference genes of cigar tobacco

圖2 候選內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.2 Melting curves of candidate reference genes

2.3 候選內(nèi)參基因表達(dá)豐度分析

內(nèi)參基因的表達(dá)水平通常用CT值來(lái)表示［21］。對(duì)10 個(gè)候選基因在10 個(gè)樣品中的CT值分布情況進(jìn)行了分析。結(jié)果（圖3）表明，10個(gè)候選內(nèi)參基因的平均CT值介于21.39（RPL8）～29.93（PSAP）之間，表達(dá)豐度分布范圍較廣。在10 個(gè)候選內(nèi)參基因中，UBC28、UBC35和AC101基因的表達(dá)水平在不同樣本中的波動(dòng)較小，所有樣本的平均CT值分別是24.66、24.00和25.21；RPL8 基因的表達(dá)水平在不同樣本中最為分散，最大是27.51，最小是21.39，平均CT值是24.4。因此，從不同組織表達(dá)量的一致性來(lái)看，UBC28、UBC35和AC101基因適合作為分析不同組織間表達(dá)變化的內(nèi)參基因。

圖3 雪茄煙葉10個(gè)候選內(nèi)參基因在不同組織器官中CT值的分布Fig.3 Distributions of CT values for 10 candidate reference genes in different tissues and organs

2.4 候選內(nèi)參基因在雪茄煙不同組織表達(dá)的穩(wěn)定性分析

由于不同樣本之間固有的差異，以及qRT-PCR反應(yīng)的操作過(guò)程中多步實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致的誤差，直接比較原始的CT值無(wú)法準(zhǔn)確評(píng)估候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，因此采用3 種常見(jiàn)的內(nèi)參基因測(cè)試軟件geNorm、NormFinder 和BestKeeper 進(jìn)行比較分析，篩選出雪茄煙葉不同組織器官中適合的內(nèi)參基因。

2.4.1 geNorm軟件分析

geNorm軟件用M值來(lái)判斷其表達(dá)穩(wěn)定性［23］。具體算法為：先找到該基因在所有樣品中最小的CT值，再用其他樣品CT值減去最低CT值，得到ΔCT值后，計(jì)算2-ΔCT值，然后通過(guò)geNorm軟件計(jì)算M值。通常適合作為內(nèi)參基因的M 值都小于等于1.5。geNorm 軟件分析結(jié)果（圖4）表明，10個(gè)候選內(nèi)參基因的M值均小于1.5，其中最小0.37（RPL14A和SP1L1），最大1.09（PSAP），說(shuō)明這些基因都可作為候選內(nèi)參基因，按照M 值由低到高排序依次為RPL14A=RPS16＜UBC27＜UBC28＜UBC35＜EIF2＜AC101＜RPL8＜CPI＜PSAP。 即在這10個(gè)候選基因中，RPL14A和RPS16基因表達(dá)最為穩(wěn)定，PSAP 基因表達(dá)最不穩(wěn)定。此外，通過(guò)geNorm 軟件計(jì)算出配對(duì)變異值Vn/n+1，當(dāng)Vn/n+1＜0.150時(shí)，n 個(gè)基因即可滿足校正目的基因表達(dá)量的要求。從圖4 中可以看出，V4/5=0.143＜0.150，表明適合候選內(nèi)參基因數(shù)目最少為4。

圖4 geNorm分析候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性（A）和最佳候選內(nèi)參基因個(gè)數(shù)（B）Fig.4 Expression stabilities（A）and optimal numbers（B）of candidate reference genes analyzed by geNorm

2.4.2 NormFinder軟件分析

NormFinder軟件計(jì)算原理與geNorm類似，所得穩(wěn)定值越小的越適合作為內(nèi)參基因［23］。分析結(jié)果如圖5 所示，10 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值從低到高排列為：UBC27＜RPL14A＜UBC28＜RPS16＜UBC35＜AC101＜EIF2＜RPL8＜CPI＜PSAP。其中UBC27 最低，為0.336 1；PSAP 最高，為0.779 2。表明最適合作為候選內(nèi)參基因的是UBC27，其次是RPL14A 和UBC28。

圖5 NormFinder分析10個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.5 Expression stabilities of 10 candidate reference genes analyzed by NormFinder

2.4.3 Bestkeeper軟件分析

Bestkeeper 軟件可以根據(jù)不同候選內(nèi)參基因在樣品中的平均CT值計(jì)算兩兩基因之間產(chǎn)生配對(duì)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）、相關(guān)系數(shù)（r）和變異系數(shù)（CV），通過(guò)比較各個(gè)值的大小，最終選擇穩(wěn)定性好的內(nèi)參基因。相關(guān)系數(shù)越大，標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因的穩(wěn)定性就越好。除了能夠分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，該軟件還可分析目的基因的表達(dá)水平［21］。

從Bestkeeper的分析結(jié)果（表3）可以看出，在10個(gè)候選內(nèi)參基因中有5 個(gè)（RPS16、CPI、PSAP、EIF2和RPL8）SD 大于1，剩余的5 個(gè)（RPL14A、UBC27、UBC28、AC101和UBC35）SD值均小于1，說(shuō)明這5個(gè)基因適合作為內(nèi)參基因。對(duì)這5個(gè)基因按照相關(guān)系數(shù)進(jìn)行排序，從高到低依次為：RPL14A、UBC27、UBC28、UBC35 和AC101，其中RPL14A 和UBC27 也是geNorm 軟件和NormFinder 軟件篩選出的適合雪茄煙葉不同組織基因定量分析的內(nèi)參基因。

表3 BestKeeper分析10個(gè)候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性Tab.3 Expression stabilities of 10 candidate reference genes analyzed by BestKeeper

2.5 候選內(nèi)參基因在鹽脅迫下表達(dá)的穩(wěn)定性分析

對(duì)10個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行了鹽脅迫下表達(dá)穩(wěn)定性分析，結(jié)果如表4所示。3種軟件的評(píng)價(jià)結(jié)果基本一致，最適合的鹽脅迫條件下的內(nèi)參基因是UBC28，其次是UBC27和RPL14A等。

表4 鹽處理?xiàng)l件下雪茄煙葉候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析Tab.4 Stability analysis of candidate reference genes under salt stress

2.6 鹽脅迫下脯氨酸合成相關(guān)基因P5CS的時(shí)間表達(dá)模式分析

脯氨酸在植物抗逆中起著重要作用，其表達(dá)變化通常被用來(lái)衡量植物對(duì)逆境的響應(yīng)情況［25-27］。分別使用RPL14A、UBC27和UBC28通過(guò)qRT-PCR對(duì)脯氨酸合成相關(guān)基因P5CS的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6 所示。分別以RPL14A、UBC27 和UBC28 作為內(nèi)參基因時(shí)P5CS的相對(duì)表達(dá)量基本一致，尤其是在鹽脅迫3 h、1 d 和7 d 時(shí)，但在鹽脅迫3 d 時(shí)以RPL14A 為內(nèi)參時(shí)的相對(duì)表達(dá)量更高；3 種內(nèi)參基因分析得到的時(shí)間表達(dá)模式非常一致，P5CS的表達(dá)在鹽脅迫的前三天逐漸升高，第7天又略有下降，各取樣時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)由高至低依次為：3 d＞7 d＞1 d＞3 h＞0 h（CK）。可見(jiàn)，RPL14A、UBC27和UBC28作為內(nèi)參基因用于雪茄煙葉鹽脅迫時(shí)的基因表達(dá)定量分析都是適合的。

圖6 雪茄煙葉鹽處理后葉片中P5CS基因相對(duì)RPL14A、UBC27和UBC28的表達(dá)量Fig.6 Expression levels of P5CS gene relative to RPL14A，UBC27 or UBC28 in cigar tobacco leaves under salt stress

3 討論

本研究中利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件對(duì)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示3種軟件中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序并不完全一致，這種情況在異色瓢蟲(chóng)（Harmonia axyridis）［10］和火龍果（Hylocereus）等［12］物種內(nèi)參基因的篩選研究中也得到相似結(jié)果。其原因可能是由于3種分析軟件處理數(shù)據(jù)的原理不同造成的。同時(shí)，本研究中選取的10個(gè)候選基因中有3個(gè)核糖體蛋白基因（RPL8、RPL14A 和RPS16）和3 個(gè)泛素結(jié)合酶基因（UBC27、UBC28 和UBC35）。從分析結(jié)果來(lái)看，3 個(gè)核糖體蛋白基因中RPL14A的穩(wěn)定性明顯高于RPL8和RPS16，3個(gè)泛素結(jié)合酶基因中UBC27和UBC28的穩(wěn)定性明顯高于UBC35，這說(shuō)明功能相似的內(nèi)參基因其表達(dá)穩(wěn)定性不一定相同。這種情況在柑橘（Citrus）［28］和堿蓬（Suaeda glauca）［29］等植物中也有相關(guān)報(bào)道。此外，根據(jù)雪茄煙葉三代測(cè)序結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)篩選出UBC27、RPL14A和UBC28等內(nèi)參基因，但可能由于數(shù)據(jù)組裝及拼接問(wèn)題未能獲得普通栽培煙草（烤煙）常用的L25等基因，因此如果想要更為全面地獲得并驗(yàn)證雪茄煙葉的內(nèi)參基因，可能需要對(duì)雪茄煙葉進(jìn)行全基因組測(cè)序方面的研究。

4 結(jié)論

①篩選出10 個(gè)適合于溫室中雪茄煙葉（BESNO H382）基因相對(duì)定量分析的候選內(nèi)參基因，分別是RPL8、RPL14A、RPS16、UBC27、UBC28、UBC35、EIF2、CPI、AC101和PSAP。②利用geNorm、NormFinder 和Bestkeeper 等3 個(gè)軟件分析了10 個(gè)候選內(nèi)參基因在雪茄煙葉不同組織器官及鹽脅迫下葉片中的表達(dá)穩(wěn)定性，表明RPL14A 和UBC27 最適合作為雪茄煙葉不同組織器官的內(nèi)參基因；UBC28 最適合作為雪茄煙葉不同鹽脅迫條件下的內(nèi)參基因。③應(yīng)用UBC27、UBC28和RPL14A作為內(nèi)參基因分析P5CS 基因在鹽脅迫下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)內(nèi)參基因的定量結(jié)果趨勢(shì)一致。