黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌種群結構及PAI致病基因分析

張鉉哲 趙 雪 陳蘇慧 徐浩然 任雪琦 朱二龍

（東北農業大學農學院，黑龍江哈爾濱 150030）

馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab，PCS）是一種由致病鏈霉菌（spp）引起的土傳病害，在各地馬鈴薯生產區幾乎均有發生。該病害的特點是馬鈴薯塊莖表皮層上有凸起、凹陷、網狀或其他類型木栓狀壞死病斑，顏色由褐色至黑色不等，其中病斑最深可造成約7 mm 的組織凹陷（劉淑娜，2019）。致病鏈霉菌除了能侵染馬鈴薯外，還能感染其他根菜類蔬菜，如胡蘿卜、蘿卜、根甜菜等，在肉質根表面形成瘡痂病斑，降低蔬菜的品質和市銷性，造成重大的經濟損失（Wanner，2004；Hill &Lazarovits，2005；Qu et al.，2008）。近幾年，馬鈴薯瘡痂病的發生越來越嚴重，很大程度上影響了馬鈴薯的市銷性。瘡痂病是由1 種或幾種鏈霉菌復合侵染引起的病害。鏈霉菌屬放線菌，種類繁多，幾乎所有的鏈霉菌都是土壤腐生菌，具有較強的抗逆性，產生的孢子在干燥條件下能長期存活。常見的致病鏈霉菌主要有3 種，即、以及（Loria et al.，1997）。是第1 個被報道的致病鏈霉菌，是全球引起瘡痂病的主要病原菌（Lambert &Loria，1989；Corrêa et al.，2015），且被認為是分布最廣的一種，其次是和（Lerat et al.，2009）。國內外對馬鈴薯瘡痂病病原菌的分類進行了大量研究，不斷有致病性鏈霉菌新菌株被發現，致病菌的組成趨于復雜化。

引起馬鈴薯瘡痂病的致病鏈霉菌具有多樣性，但致病性的基因和機制似乎在引起瘡痂病的鏈霉菌中共享。致病菌的致病基因聚集在染色體一個大的區域中，且該區域具有在鏈霉菌種間水平移動的特點，可以水平轉移到新的鏈霉菌物種中以產生致病性物種或菌株，從而起到致病島（pathogenicity island，PAI）作用。該致病島上參與毒素合成及調控的基因有、、、、、等（Healy et al.，2002；Kers et al.，2004；Joshi et al.，2010）。目前研究最多的基因是、和基因。

為了解黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌的種類和鏈霉菌PAI 致病基因的特點，本試驗從黑龍江省不同馬鈴薯種植地區采集具有典型馬鈴薯瘡痂病癥狀的薯塊，進行瘡痂病菌的分離，通過病原菌的形態特征、生理生化特性結合鏈霉菌16S rDNA 序列對病原菌進行分類鑒定，并檢測、和3種PAI 致病基因的組成，以期為追蹤馬鈴薯瘡痂病相關鏈霉菌的進化歷史和傳播資源，也為有效防治馬鈴薯瘡痂病提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯瘡痂病菌的采集與分離

2018—2020 年馬鈴薯收獲期間，在黑龍江省牡丹江市、雞西市、綏化市、鶴崗市、佳木斯市及哈爾濱市等馬鈴薯主產區采集瘡痂病薯塊。參考趙偉靖（2018）稀釋分離法進行瘡痂病菌的分離。在無菌條件下，選擇白色粉狀單菌落，劃線純化3 次，將純化后的菌株編號保存，備用。

1.2 鏈霉菌的致病性測定

參考趙偉靖（2018）的方法利用蘿卜幼苗法測定分離菌株的致病性。挑選已發芽長勢一致的蘿卜種子放入含有1%水瓊脂的試管內，每支試管3 粒，接種10CFU·mL的馬鈴薯瘡痂病菌菌懸液200 μL，以接種等量無菌水的處理作為空白對照。于光照培養箱中每天16 h 光照、8 h 黑暗培養7 d 后，統計蘿卜幼苗的長度并計算病原菌對蘿卜幼苗的抑制率。

抑制率=（1 -處理幼苗平均長度/對照幼苗平均長度）× 100%

1.3 致病鏈霉菌的鑒定

1.3.1 形態觀察 挑取長勢良好的致病鏈霉菌單一菌落，劃線接種于ISP2 培養基（酵母提取物4 g，麥芽糖提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL）平板上，28 ℃黑暗條件下培養7 d，觀察各測試菌株的色素產生情況。將菌株接種于高氏1 號培養基（可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KHPO0.5 g，KNO1.0 g，MgSO·7HO 0.5 g，FeSO·7HO 0.01 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL）平板上，置于28 ℃培養箱中培養，14 d 后測試菌株充分生長，觀察菌落形態及孢子鏈形態等特征。孢子鏈形態觀察采用印片法（殷修魯，2018）。

1.3.2 生物學特性測定 參考徐麗華等（2007）的方法對馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌的黑色素產生、硫化氫產生、纖維素利用、明膠液化、淀粉酶產生、碳源利用、氮源利用、敏感性等進行測定。

1.3.3 分子生物學鑒定 鏈霉菌總DNA 的提取采用細菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進行，用鏈霉菌16S rDNA 通用引物PA/PH 進行檢測（李馳 等，2019）。PCR 產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序，將序列拼接處理后的基因序列通過NCBI 進行Blast比對，構建系統發育樹，對菌株進行同源性分析。

1.4 致病鏈霉菌的PAI 致病基因檢測

通過PCR 的方法檢測致病鏈霉菌的致病基因類型，檢測菌株中是否含有、和致病基因，引物序列、PCR 擴增反應條件和體系參考李馳等（2019）方法，PCR 擴增結果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，統計致病菌株的致病基因組成情況。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病菌的分離純化

2018—2020 年每年8—9 月馬鈴薯收獲時節，采用5 點取樣法從黑龍江省共6 個市8 個采樣點的馬鈴薯主產區采集瘡痂病薯塊，得到154 份馬鈴薯瘡痂病樣品，進行菌株分離，挑選具有鏈霉菌形態特征的單菌落，純化菌株，共分離得到鏈霉菌菌株312 株（表1）。

表1 2018—2020 年黑龍江省各馬鈴薯主產區樣品采集與菌株分離統計

2.2 鏈霉菌菌株的致病性測定

利用蘿卜幼苗法測定純化的鏈霉菌菌株的致病性，根據鏈霉菌菌株是否會對蘿卜幼苗的生長產生抑制判斷其致病能力。結果表明，與空白對照相比，致病菌株使蘿卜幼苗的生長受到明顯抑制，抑制率均在45%以上，且使根須的數量減少（圖1）。通過蘿卜幼苗法從分離純化的312 株鏈霉菌菌株中篩選出263 株致病鏈霉菌，致病菌株所占比例達到84%。各地區致病菌株數及所占比例有差異，在哈爾濱市香坊區、呼蘭區和阿城區3 個地點共分離鏈霉菌菌株131 株，致病菌株為109 株，所占比例約為83%，其中香坊區致病鏈霉菌菌株所占比例為80%，呼蘭區所得鏈霉菌菌株全為致病菌株，即所占比例為100%，阿城區獲得21 株鏈霉菌菌株，致病菌株占比達到76%；佳木斯市共分離78 株鏈霉菌菌株，致病菌株為59 株，所占比例為76%；鶴崗市致病鏈霉菌菌株為36 株，所占比例為90%；綏化市5 個分離菌株中致病菌株所占比例為100%；牡丹江市致病菌株所占比例為90%；雞西市為95%（表1）。

圖1 蘿卜幼苗法測定菌株的致病性

2.3 致病鏈霉菌的鑒定

2.3.1 形態觀察 將263 株鏈霉菌致病菌株在ISP2 培養基平板上黑暗培養7 d，MDJ-1、AC-1、SH-4、JMS-17 和HL-23 等5 個菌株對蘿卜幼苗的抑制效果明顯，且形態各異，因此選擇這5 個菌株進行觀察鑒定。MDJ-1 和AC-1 菌株能在ISP2 培養基上產生褐色色素，其余菌株均無色素產生（圖2-A）。菌株菌落表面粗糙，形狀有圓形和邊緣不規則兩種，多數菌落菌絲平鋪于培養基上，但AC-1菌株的菌落中央凸起；大部分菌株菌落表面能產生無色小液滴，僅SH-4 菌株無液滴產生（圖2-B）。MDJ-1 和AC-1 的孢子鏈為螺旋狀，SH-4、JMS-17 和HL-23 的孢子鏈形態為直柔狀（圖2-C）。

圖2 致病鏈霉菌色素的產生、菌落形態及孢子鏈顯微形態（400 倍）

2.3.2 生物學特性測定 對5 株具有代表性的菌株進行黑色素產生、硫化氫產生、纖維素利用、明膠液化、淀粉酶產生、碳源利用、氮源利用、敏感性等生理生化特性測定。詳細結果見表2。

表2 致病鏈霉菌菌株生理生化特性

2.3.3 分子生物學鑒定 用鏈霉菌通用引物PA/PH對5 個代表性菌株DNA 進行PCR 擴增，PCR 產物測序后，將所得序列于NCBI 進行序列Blast 比對，并通過Mega 7.0 軟件對序列進行多重比對，構建系統發育樹，以確定測試菌株的種類。從圖3 可以看出，代表性菌株MDJ-1 與親緣關系最近，序列在NCBI 中Blast 比對同源性達到99%。哈爾濱市阿城區的代表性菌株AC-1 與親緣關系相近，同源性為99%。菌株JMS-17 與親緣關系最近，Blast 比對同源性為99%。SH-4 與的同源性為99%，HL-23 與的同源性為99%。

圖3 根據16S rDNA 基因序列構建的系統發育樹

2.4 黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌種類分析

從黑龍江省6 個市8 個采樣點共分離得到、、、、等5 種致病性鏈霉菌。263 株致病菌株中，127 株為，占比48.3%；14 株為，占比5.3%；46 株為，占比17.5%；24 株為，占比9.1%；52 株為，占比19.8%。各地區病原菌種類結果如下（表3）：哈爾濱市有3 種，其中香坊區為（39 株）和（30 株），呼蘭區為（24 株），阿城區為（16 株）；佳木斯市有2 種，分別為（45株）和（14 株）；鶴崗市有（24 株）和（12 株）2 種；綏化市為（5 株）；牡丹江市為（19 株）；雞西市為（35 株）。其中，分布最廣泛，在哈爾濱市、佳木斯市、鶴崗市和牡丹江市均有分布。

表3 致病鏈霉菌種屬的地區分布

2.5 致病鏈霉菌PAI 致病基因的檢測

對分離的263 株致病菌株進行PAI 致病基因（、和）的檢測，用3 種致病基因引物進行PCR 擴增，經凝膠電泳檢測，共檢測出2 種致病基因類型，分別為和。其 中和的致病基因類型均為。、和致病基因類型均為（表3）。哈爾濱市和鶴崗市均具有2 種致病基因型，其中哈爾濱市香坊區致病基因型和的分離比率為56.5%和43.5%，鶴崗市和的分離比率分別為66.7%和33.3%。

3 討論與結論

由致病鏈霉菌（spp.）引起的馬鈴薯瘡痂病是一種嚴重的土傳病害，已報道的病原菌種類較多。目前黑龍江省已報道的鏈霉菌有、、和4 種病原菌（邢瑩瑩 等，2016；楊德潔等，2018）。本試驗從黑龍江省6 個市采集了154份馬鈴薯樣品，分離出312 株鏈霉菌菌株，利用蘿卜幼苗法測定菌株致病性，共獲得263 株致病菌株，結合致病菌株的形態學、生理生化特性和分子生物學特征進行分類鑒定。結果表明，各地區致病菌種類有差異，6 個市共分離到5 種致病鏈霉菌、、、、，說明黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌具有多樣性。是分布范圍最廣的種類，分離率達到全部致病菌的48.3%，、和是黑龍江省首次報道的馬鈴薯瘡痂病菌。

基因的水平轉移在細菌進化中發揮著重要作用，使細菌快速獲得新的性狀以提高對特殊環境（包括與致病相關的真核寄主）的適應能力。細菌菌株可能含有1 個或多個PAI 致病基因，親緣關系相同的菌株可能含有不同的PAI（增加或完全缺失PAIs），該PAI 是使農業系統中出現新的植物致病鏈霉菌種的原因（Kers et al.，2005；Lapaz et al.，2017）。致病基因在病原菌致病性中起著重要作用，PAI 致病基因存在種內和種間水平轉移的特性，可以從致病鏈霉菌中轉移至非致病鏈霉菌中，改變菌株的致病基因組成，使致病基因類型多樣化、復雜化，最終導致新致病菌的產生（Armijos-Jaramillo et al.，2017）。具有遺傳多樣性的鏈霉菌分離株中高度保守的致病基因是測定致病性的理想分子標記。例如，基因已被用作育種計劃中潛在致病性的遺傳標記，該基因編碼一種分泌的壞死蛋白（Joshi et al.，2007），的異位表達足以將非致病性鏈霉菌轉化為致病菌（Bukhalid &Loria，1997；Bukhalid et al.，1998）。有報道認為基因在非親緣病原鏈霉菌中結構和功能高度保守，而在非致病性菌株中不存在（Bukhalid et al.，1998；Kreuze et al.，1999）。致病性、和菌株可能同時含有基因和毒素thaxtomin A，但thaxtomin A 的產生不需要（Bukhalid &Loria，1997；Bukhalid et al.，1998）。Joshi 等（2007）研究表明對于致病性是必要的，但也有人認為它在致病性中起輔助作用（Bukhalid et al.，1998），因為Wanner（2004）發現其在鏈霉菌的其他一些致病菌株中缺失。本試驗將分離鑒定的具有代表性的菌株進行PAI 致病基因（、和）的PCR 擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外凝膠成像系統觀察。結果表明，致病基因的組成類型有2 種，即和，大多數菌株均含有全部3種致病基因，、和含有和，但缺乏，是非典型的致病基因組成類型，有些地區缺少含有全部3 種致病基因的分離株，因此，在這些地區對致病鏈霉菌PAI 基因的組成還需進一步調查。