三種益生菌與低聚果糖復合粉對小鼠免疫功能的影響

蘇碩楠，侯林中

（唐山市工人醫院，河北唐山 063003）

腸道內特定的微生物群可有效維持免疫平衡，并對人體健康起著至關重要的作用，當正常微生物群遭到破壞則打破了腸道免疫系統平衡，可能會引發疾病[1?2]。益生菌可通過改善腸道微生物構成、產生抗炎因子、抑制病原菌群生長，從而預防和治療一些消化道疾病[3?5]。乳桿菌屬（Lactobacillus）細菌是腸道正常菌群中益生菌的重要成員，近年來越來越引起食品科學、微生物學、微生態學等領域的關注[6?8]。

乳雙歧桿菌V9（Bifidobacterium lactisV9，B.lactisV9）、干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus caseiZhang，L.caseiZhang）、植物乳桿菌P-8 （Lactobacillus plantarumP-8，P-8）均為國內外目前用于開發的重要的Lactobacillus屬細菌[9?11]。這三種菌株均具有良好的耐酸性，能夠較好的耐受人工胃液、腸液以及膽鹽，是目前國內外重點研究開發的益生菌[12?13]。越來越多研究證明，Lactobacillus屬細菌對維持腸道微生態平衡，增強腸道免疫功能尤為重要[5，14]。

不同乳酸菌株的免疫調節功能因菌株類型而異。一方面是由于不同菌株細胞壁構成不同，其對免疫細胞的影響也不同[5]。另外一方面，不同的乳酸菌產生的胞外多糖等代謝產物亦不同，其對免疫力的影響也不同[15?17]。低聚果糖（fructo-oligosaccharide，FOS）是一種不易被小腸吸收的膳食纖維，可促進腸道中雙歧桿菌的生長，抑制病原菌生長，從調節腸道菌群[18?19]。研究表明，益生菌與低聚果糖等益生因子合用可更好地調節機體免疫力[20]。但益生菌V9、P-8、Zhang 與FOS 聯合使用對免疫系統的影響尚未見研究報道。本文重點通過檢測三種益生菌（乳雙歧桿菌V9、干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8）與低果聚糖復配的益生復合粉（BLLF）對小鼠免疫臟器指數、細胞免疫、單核-巨噬細胞功能、體液免疫及NK 細胞活性的影響，以探討其對小鼠免疫功能的調節作用，為其開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳雙歧桿菌V9（活菌數2000 億/g）、干酪乳桿菌Zhang（活菌數2000 億/g）、植物乳桿菌P-8 菌粉（活菌數2000 億/g）、低聚果糖 金華銀河生物科技有限公司；刀豆蛋白A（ConA）、二硝基氟苯（DNFB）

Sigma 公司；Hank's 液、RPMI1640 培養基、胎牛血清 美國Gibco 公司；MTT 試劑盒、LDH 檢測試劑盒 英國Abcam 公司；淋巴細胞分離液、0.4%臺盼蘭溶液 北京索萊寶科技有限公司；印度墨汁、YAC-1 細胞、20%雞紅細胞 上海源葉生物科技有限公司；1% NP40、0.2 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH=8.2） 碧云天生物科技有限公司；C57BL/6J 小鼠（雄性，18~22 g） 購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養環境：室溫（23±2）℃，相對濕度：40%~70%。

MS3 基本型旋渦混合器 德國IKA 公司；去離子水發生器 美國Millipore 公司；Multiskan MK3型酶標儀 美國Thermo Scientific 公司；721 型分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；CX33 顯微鏡日本奧林巴斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及給藥 參考文獻配比比例[15?16]，稱取冷凍干燥保存的乳雙歧桿菌V9、干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8，按照質量比50:25:25 的比例用雙蒸水溶解至所需濃度后，備用。低聚果糖用雙蒸水溶解至所需濃度后，備用。將小鼠隨機分為8 個免疫組，每個免疫組分為4 個實驗組，即蒸餾水組（空白組）、BLLF 低、中、高劑量組（三聯菌0.01 mg/kg+低聚果糖0.1 g/kg、三聯菌0.02 mg/kg+低聚果糖0.1 g/kg、三聯菌0.06 mg/kg+低聚果糖0.1 g/kg）0.1 mL/10 g 體重，每日灌胃1 次，連續30 d。按照文獻中增強免疫力的研究方法對BLLF 進行評價[21?24]。

1.2.2 小鼠體重及免疫臟器指數的測定 每周稱量一次各組小鼠的重量，實驗當天稱重結束后頸椎脫臼處死，無菌取出小鼠的脾臟、胸腺，將周圍組織剝離干凈，用濾紙吸凈組織表面血液后，稱重，分別計算胸腺或脾臟重量（mg）與體重（g）的比值[25]。

1.2.3 ConA 誘導小鼠脾淋巴細胞轉化實驗 無菌取脾，磨碎后過濾，制成濃度為3×106個/mL 的單細胞懸液。每孔1.0 mL，加至24 孔培養板中，實驗組加75 μL ConA/孔（終濃度為7.5 μg/mL），對照組加75 μL 無菌水，繼續培養72 h。測定實驗孔和對照孔在570 nm 處的OD 值[26?27]。

1.2.4 DNFB 誘導小鼠遲發型變態反應（DTH）實驗（耳腫脹法） 小鼠腹部脫毛后，取50 μL 1% DNFB溶液，均勻涂抹在小鼠腹部皮膚進行致敏反應。5 d后，取20 μL 1% DNFB 溶液均勻涂抹右耳上，左耳作為對照。24 h 后處死小鼠，采用打孔器取相同大小的左右耳片進行稱重。以兩耳片的重量之差表示DTH 的程度[28?29]。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗（半體內法） 取20%雞紅細胞懸液1 mL，腹腔注射進入小鼠體內。30 min 后脫臼處死，經腹腔注入生理鹽水2 mL，轉動鼠板1 min 后，吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2 片載玻片上，37 ℃保濕孵育30 min。生理鹽水漂洗后，1:1 丙酮-甲醇溶液固定，4%（v/v）Giemsa-磷酸緩沖液染色3 min，蒸餾水漂洗晾干，油鏡下觀察計數，計算吞噬指數和吞噬百分率[30]。

1.2.6 小鼠碳廓清實驗 將用生理鹽水4 倍稀釋的印度墨汁尾靜脈注入小鼠0.1 mL/10 g。于注入墨汁第2、10 min 分別從內眥靜脈叢取血20 μL，加到2 mL 0.1% Na2CO3溶液中。以Na2CO3溶液為空白對照，用分光光度計在600 nm 波長處測定OD 值并計算吞噬指數α[24，31]。

1.2.7 抗體生成細胞測定 收集綿羊紅細胞（SRBC），用生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射0.2 mL 進行免疫。4d后處死小鼠，無菌條件下取脾臟，制備脾細胞懸液，用生理鹽水稀釋成5×106個/mL 的脾細胞懸液。用Jerne 改良玻片法檢測抗體生成細胞[23]。

1.2.8 血清溶血素測定 同1.2.7 方法免疫小鼠，4 d后，摘除眼球血于離心管中，收集血清。取300 倍稀釋后的血清1.0 mL，依次加入10% SRBC 0.5 mL、補體1.0 mL，反應20 min 后，離心取上清1.0 mL，加都氏試劑3.0 mL。以10% SRBC 0.25 mL 加都氏試劑4.0 mL 混勻后作空白對照。540 nm 處測定各管光密度值，計算半數溶血值（HC50）[22?23]。

1.2.9 小鼠NK 細胞活性測定 收集YAC-1 細胞，調整細胞濃度至4×105個/mL。無菌取脾，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為2×107個/mL。取靶細胞和效應細胞各100 μL（效靶比50:1），加入U 型96 孔培養板中，以加靶細胞+培養液各100 μL 的孔作為靶細胞自然釋放孔，以加靶細胞+1% NP40 各100 μL的孔作為靶細胞最大釋放孔。培養箱中繼續培養4 h，1500 r/min 離心，每孔吸取上清100 μL 到平底96 孔培養板中，加入LDH 基質液100 μL，反應3 min，每孔加入1 mol/L 的HCl 30 μL，490 nm 處測定OD 值，計算NK 細胞活性[24]。

1.3 數據處理

數據以均數±標準差表示，每組n=10，采用SPSS 10.0 軟件分析，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）檢驗，成對組間比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 小鼠體重、胸腺、脾臟指數測定結果

實驗期間，各組小鼠一般狀況良好，未發現納差、腹瀉、中毒或自然死亡等現象。各組小鼠的初始體重和終末體重均無顯著性差異(P>0.05)，提示低、中、高劑量組BLLF 對健康小鼠均無明顯毒性（見表1）。衡量機體免疫功能的指標為免疫器官的臟器系數，其中，胸腺和脾臟指數主要以反映免疫器官的發育和免疫細胞的功能狀況為主，同時，間接反映了機體的整體免疫水平[25]。低、中、高劑量組的BLLF 對小鼠免疫臟器指數的影響結果詳見表1。結果顯示，給予小鼠BLLF 連續灌胃30 d，低、中、高劑量組小鼠的脾臟/體重比值、胸腺/體重比值與空白對照組相比差異均無統計學意義（P>0.05）。結果表明BLLF 對小鼠的免疫器官的重量無顯著影響，進一步證明了其安全性。

表1 BLLF 對小鼠臟器/體重比值的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of BLLF on mice organs ratios to body weight (±s, n=10)

表1 BLLF 對小鼠臟器/體重比值的影響（±s，n=10）Table 1 Effects of BLLF on mice organs ratios to body weight (±s, n=10)

組別 初始體重（g）終末體重（g）脾臟/體重（mg/g）胸腺/體重（mg/g）空白對照組 20.47±1.14 30.14±1.07 2.56±0.74 2.26±0.58低劑量BLLF組 20.15±1.37 29.25±2.01 2.55±0.47 2.54±0.81中劑量BLLF組 20.75±1.50 29.46±1.59 2.84±1.31 2.15±0.95高劑量BLLF組 20.45±1.05 30.36±1.67 2.91±1.14 2.10±0.45

2.2 不同劑量BLLF 對小鼠細胞免疫功能的影響

T 淋巴細胞受到ConA 刺激后會轉化為母細胞持續增殖。通過MTT 法檢測其細胞增殖能力可以反映細胞免疫功能的強弱[25]。不同劑量BLLF 對ConA 促進脾淋巴細胞增殖作用結果見表2。統計發現，低、中、高劑量BLLF 組的OD 差值與對照組的OD 差值間均無顯著性差異（P>0.05）。本實驗結果表明BLLF 對小鼠的脾淋巴細胞的增殖能力無顯著影響。

表2 BLLF 對ConA 誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力及耳廓腫脹度的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of BLLF on ConA-induced mouse splenic lymphocyte transformation ability and auricle swelling degree (±s, n=10)

表2 BLLF 對ConA 誘導的小鼠淋巴細胞增殖能力及耳廓腫脹度的影響（±s，n=10）Table 2 Effects of BLLF on ConA-induced mouse splenic lymphocyte transformation ability and auricle swelling degree (±s, n=10)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；表3~表5同。

組別脾淋巴細胞增殖能力（OD570 nm）耳廓腫脹度（mg）ConA（?） Con（+） OD差值空白對照組 0.41±0.12 0.85±0.09 0.44±0.11 12.01±1.04低劑量BLLF組 0.42±0.10 0.87±0.08 0.45±0.09 13.18±2.12中劑量BLLF組 0.44±0.07 0.93±0.14 0.49±0.12 15.45±2.04*高劑量BLLF組 0.46±0.09 1.01±0.13 0.55±0.13 16.50±2.25*

DNFB 涂抹于小鼠耳廓后，可引起遲發性變態反應，導致鼠耳局部組織增厚。小鼠耳廓腫脹度可反映小鼠細胞免疫功能的強弱[25]。表2 中的數據顯示，中、高劑量BLLF 組的耳廓腫脹度顯著（P＜0.05）高于空白對照組。本實驗結果表明BLLF 可增強DNFB 誘發的遲發性變態反應，正向調控小鼠的細胞免疫功能。研究表明，益生菌可影響腸道黏膜免疫細胞群的數量和分布，增強腸道免疫功能。低果聚糖在腸道不可被消化吸收，也可以促進腸道有益菌的增殖，進而增強益生菌免疫調控作用[19]。

2.3 不同劑量BLLF 對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

單核-巨噬細胞是具有抗感染、抗腫瘤和免疫調節作用的免疫細胞，反映了機體非特異性免疫反應的強弱。當機體受到病原體或異物侵入時，這些巨噬細胞能向這些部位募集，并通過胞吞作用吞噬并消化分解異物[26]。由表3 可知，給予小鼠低、中、高劑量的BLLF 30 d 后，與對照組相比，高劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬率和吞噬指數均顯著（P＜0.05）升高。

表3 BLLF 對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n = 10）Table 3 Effects of BLLF on the function of monocyte macrophage of the mice (±s, n=10)

表3 BLLF 對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響（±s，n = 10）Table 3 Effects of BLLF on the function of monocyte macrophage of the mice (±s, n=10)

組別單核-巨噬細胞功能 小鼠碳廓清能力吞噬率（%） 吞噬指數 吞噬指數（α）空白對照組 16.57±3.68 0.23±0.10 6.18 ±1.34低劑量BLLF組 18.26±3.24 0.29±0.05 7.04±1.12中劑量BLLF組 17.24±4.05 0.26±0.14 7.86±0.56*高劑量BLLF組 31.35±2.56* 0.50±0.12* 8.27±0.89*

BLLF 對小鼠碳廓清功能的影響結果見表3。其中中、高劑量組小鼠的吞噬指數α與空白對照組相比具有統計學差異（P＜0.05）。與對照組相比，中、高劑量組碳廓清功能顯著升高（P＜0.05）。這一結果表明BLLF 能有效增強小鼠巨噬細胞的吞噬能力，提示小鼠非特異性免疫能力明顯增強。這可能是益生菌與低果聚糖共同作用的結果。益生菌可增強巨噬細胞的吞噬活性，當腸道受到到病原體或異物侵入時，這些巨噬細胞能向這些部位募集，并通過胞吞作用吞噬并消化分解異物，增加腸道防御能力。低果聚糖在腸道不可被消化吸收，且在腸道可促進腸道雙歧桿菌的增殖[19]。

2.4 不同劑量BLLF 對小鼠體液免疫功能的影響

溶血空斑試驗可用于體外檢測和計數抗體生成細胞數目[31]。空斑的數量是反映機體的體液免疫功能的重要指標。低、中、高三個劑量BLLF 組與空白對照組的空斑數（每106脾細胞）見表4。統計分析結果表明，中、高劑量組的空斑數與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05），說明給予BLLF 能明顯提高小鼠體液免疫功能。

表4 BLLF 對小鼠抗體生成細胞與血清溶血素檢測結果（±s，n=10）

Table 4 Effects of BLLF on number of antibody producing cells and hemolytic activity (±s, n=10)

表4 BLLF 對小鼠抗體生成細胞與血清溶血素檢測結果（±s，n=10）

組別 空斑數（每106脾細胞） HC50空白對照組 16±4 64.25±14.58低劑量BLLF組 18±2 73.43±18.37中劑量BLLF組 29±6* 95.68±10.54*高劑量BLLF組 30±4* 106.83±16.58*

小鼠體內產生的抗體溶血素在補體的參與下，與SRBC 共同孵育發生溶血反應，釋放血紅蛋白，而通過測定血紅蛋白含量能反映動物產生溶血素的能力[24,26]。HC50的測定可評價SRBC 細胞發生溶血反應產生溶血素的能力。低、中、高三個劑量BLLF 組與空白對照組的HC50值見表4。統計分析結果表明，中、高劑量組的HC50值與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。這進一步證明，BLLF 可顯著提高小鼠的體液免疫功能。益生菌可通過調節抗炎因子、轉錄因子等的分泌影響局部和整體的免疫應答反應，產生相應的抗體。低果聚糖也可以機體血清IgG 抗體的濃度，進而增強益生菌的體液免疫功能[20]。

2.5 不同劑量BLLF 對小鼠NK 細胞活性的影響

NK 細胞是機體重要的免疫細胞，其活化后可合成和分泌多種細胞因子，發揮免疫調節及靶細胞殺傷作用[28?29]。低、中、高三個劑量BLLF 組與空白對照組的NK 細胞活性見表5。統計分析結果表明，中、高劑量BLLF 組NK 細胞活性顯著高于對照組（P＜0.05）。這表明，中、高劑量BLLF 可顯著增強NK 細胞的活性，進而提高機體靶細胞對NK 細胞殺傷的敏感性。益生菌及其代謝產物可通過增強機體的免疫反應，提高NK 細胞的殺傷活性。低果聚糖也可以調控如INFγ/IL-4、IL-10、TGF-β等的分泌，進而增強益生菌的體液免疫功能[20]。

表5 BLLF 對NK 細胞活性的影響（±s，n=10）Table 5 Effects of BLLF on NK cell activities (±s, n=10)

表5 BLLF 對NK 細胞活性的影響（±s，n=10）Table 5 Effects of BLLF on NK cell activities (±s, n=10)

組別 NK細胞活性（%）空白對照組 24.17±10.42低劑量BLLF組 27.24±14.15中劑量BLLF組 36.51±10.28*高劑量BLLF組 38.67±9.38*

3 討論與結論

乳酸菌能夠調節腸道微生物區系的平衡，在增強機體抵抗力方面具有不可低估的作用[6?7，32]。研究證實，不同益生菌株對免疫功能的影響也不同[3?5]。研究表明，不同的乳酸菌進入機體后，能通過不同的機制激活腸黏膜免疫系統，起到保護機體免受感染源的侵襲、抗突變和防癌、預防糖尿病和心血管疾病的作用[5,32?33]。趙雯等[32]研究表明，熱滅活的乳雙歧桿菌BL-99 能夠通過增強免疫球蛋白A 的分泌，促使腸黏膜淋巴細胞的增殖，增強自然殺傷細胞和巨噬細胞功能等機制增強機體免疫力。乳雙歧桿菌M8 可以通過增加淋巴細胞比例、T 淋巴細胞轉化增殖能力和促進細胞因子分泌等機制改善細胞免疫、體液免疫及固有免疫，從而增強免疫功能低下的大鼠的免疫功能[33]。

隨著益生菌產業的快速發展，多元化的復合益生菌產品不斷涌現。研究表明，低聚糖類益生元可作為益生菌的營養和能量來源，協同促進益生菌在腸道的定植和功效發揮，增強益生菌的免疫保護功能。Finamore 等[34]研究發現，乳桿菌與長雙歧桿菌的復合制劑能增強T 細胞、B 細胞的功能和NK 細胞活性進而提高機體免疫力。朱自平等[20]研究表明，嗜酸乳桿菌LA85 和低聚果糖復配組成合生元菌劑可顯著增加小鼠遲發型變態反應、淋巴細胞轉化能力、抗體生成細胞數、HC50值，并可提高小鼠單核-巨噬細胞吞噬能力和NK 活性。本研究評估了三種益生菌與低聚果糖復配的益生復合粉對機體免疫能力的影響，為其開發和利用提供實驗依據。胸腺、脾臟是動物體內主要的免疫器官，胸腺和脾臟指數能反映免疫器官的發育和免疫細胞的功能狀況[23?25]。本研究結果表明，各劑量BLLF 組小鼠脾臟指數和胸腺指數無差異。這初步明確了給予高、中、低劑量BLLF對小鼠的安全性。其急性毒性、遺傳毒性、亞慢性毒性等尚需進一步的體內外實驗驗證。

ConA 誘導的T 細胞增殖轉化率和DNFB 誘導小鼠DTH 常用來反映細胞免疫能力的強弱。近年來關于乳酸菌對遲發型超敏反應（DTH）的影響已有一些報道。如乳酸菌Lactobacillus casei（L. casei）活菌體細胞呈時間和濃度依賴性地增強鼠體內抗原特異性的DTH 效應[35]。本研究結果表明，BLLF 對ConA 誘導的脾淋巴細胞轉化無顯著影響（P>0.05），而中、高劑量BLLF 組的耳廓腫脹度顯著高于空白對照組（P＜0.05）。這與文獻報道相符[34?35]。

乳酸菌細胞壁肽聚糖、脂磷壁酸或胞外多糖等成分激活免疫系統的巨噬細胞。常見的雙歧桿菌、乳酸桿菌和鼠李糖乳桿菌都可以有效提高巨噬細胞的吞噬能力[32,34]。本研究結果表明，高劑量BLLF 可顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬能力（P＜0.05），中、高劑量BLLF 可顯著增加小鼠碳廓清功能（P＜0.05）。益生菌細胞壁肽聚糖的主要成分是胞壁酰二肽，可激活巨噬細胞釋放IL-1 和IL-6，誘導淋巴細胞產生IFN-γ，增強NK 細胞的殺傷作用[32?35]。本研究結果表明，中、高劑量BLLF 可顯著增強NK 細胞的活性（P＜0.05）。

綜上所述，BLLF 可通過增強細胞免疫、單核-巨噬細胞功能、體液免疫及NK 細胞活性來增強小鼠的免疫系統水平。該制劑與其他益生菌復方制劑的相比，其對免疫功能的調控機制相似，但確切的分子水平的調控機制尚需進一步研究。本研究為乳雙歧桿菌V9、干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8、FOS組成的復合制劑的增強免疫力的功能提供了基礎數據支持，也為其進一步的開發和利用奠定了基礎。