QuEChERS-超高效液相色譜法測定谷物及油籽中氰氟草酯和氰氟草酸殘留量

彭紅霞，劉 婭，楊 麗 ，呂新明，徐新忠，徐 鑫，王 珂

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子 832000；2.阿拉山口海關技術中心，新疆阿拉山口 833418；3.哈密市市場監督管理局，新疆哈密 839000）

氰氟草酯（Cyhalofop-butyl）是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，其商品名為千金（Clincher），代號為XDE-537，化學名稱為（R）-2-[4（4-氰基-2-氟苯氧基）苯氧基]丙酸丁酯[1?2]。氰氟草酸（Cyhalofop-acid）是氰氟草酯的主要代謝產物，也是除草活性物質[3]。氰氟草酯和氰氟草酸在禾本科雜草中使用后，很快分解為能抑制雜草中乙酰輔酶A 羧化酶的殺草活性化合物，阻止脂肪酸的合成，起到除草的作用[4?7]。

氰氟草酯和氰氟草酸屬于含氟農藥，在現代農業中，含氟農藥已廣泛應用于霉菌、害蟲、雜草的防治，以提高蔬菜、水果和農作物的生產力和品質。由于使用量大，含氟農藥經常在農產品中檢出，并通過食物鏈的積累對人體健康構成威脅，過量攝入氟化物會導致骨氟中毒、尿石癥、急性胃炎、腎臟損害，甚至癌癥等[8]。因此，氰氟草酯和氰氟草酸的定量測定和監測對人類健康具有重要意義。但是，我國目前幾乎沒有關于同時測定植物源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸殘留量的標準。國家標準GB 23200.4（原檢驗檢疫行業標準SN/T 1737.4）《食品安全國家標準除草劑殘留量檢測方法第4 部分：氣相色譜-質譜/質譜法測定食品中芳氧苯氧丙酸酯類除草劑殘留量》中，采用氣相色譜-質譜/質譜法測定氰氟草酯，但未涉及氰氟草酸的測定方法；日本檢測標準JAP-113《氰氟草酯和二甲吩草胺檢測方法》中，采用氣相色譜法和氣相色譜質譜/質譜法進行定量與確證氰氟草酯，仍未涉及氰氟草酸的測定方法；歐盟農藥殘留限量標準對谷物和果蔬均有限量，其中谷物限量為0.02 mg/kg，油料限量為0.05 mg/kg。

在科研領域，氰氟草酯的測定方法包括高效液相色譜法（HPLC）[9?10]、液相色譜質譜/質譜法（LCMS/MS）[11]、氣相色譜法（GC-ECD）[12]和氣相色譜質譜/質譜法（GC-MS/MS）[13?14]，但是同時測定氰氟草酯和氰氟草酸殘留量的報道也較少，加之糧谷類等植物源性食品[15]的基質成分很復雜、干擾雜質很多，因此，找到一個高效、合理的前處理方法是必要的。2003 年趙莉等[9]和2017 年董婷等[16]探索了稻田水、土壤等中的氰氟草酯及其代謝化合物的殘留量的檢測方法，但其使用的二氯甲烷萃取法速度較慢。2017 年，孫明娜等[17]運用高效液相色譜-串聯色譜技術，選擇不同的離子源，檢測稻田水和土壤中的氰氟草酯和氰氟草酸，但離子源的更換導致檢測過程有諸多不便。Anastassiadas 等[18]確立的分散固相萃?。≦uEChERS）技術后被優化推廣，稱得上是快速農殘檢測的首選前處理技術[19?23]。2019 年，李菊穎等[24]使用QuEChERS 前處理方法檢測了田水、土壤、水稻植株、水稻稻殼和糙米中的氰氟草酯和氰氟草酸的殘留量，但涉及的樣品種類少。

本實驗經過優化QuEChERS 各類填料的配比、提取和凈化體系，調整超高效液相色譜的色譜條件，創建了一種準確、高效的QuEChERS-UPLC 分析方法，該方法能夠同時檢測谷物類的大米、玉米、大麥、小麥、燕麥和油籽類的花生、大豆等植物源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸的殘留量，為進出口食品安全檢測工作提供了技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆、花生 市售，經研磨器粉碎后備用；氰氟草酯標準品 純度99.37%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh；氰氟草酯標準品純度99.9%，Dr. Ehrenstorfer Gmbh；甲醇、乙腈 色譜純，上海西格瑪奧德里奇；N-丙基乙二胺（PSA）、C18北京振翔科技；氯化鈉 分析純，天津光復科技；無水硫酸鎂 分析純，天津致遠；磷酸 分析純，天津風船；甲酸 分析純，上海西格瑪奧德里奇；QuEChERS 萃取鹽包 內容物：無水硫酸鎂、醋酸鈉美國安捷倫；超純水 電阻率18.2 MΩ·cm，25 ℃。

ACQUITY UPLC 超高效液相色譜儀 美國Waters 公司；Cascada I 實驗室超純水機 美國Pall公司；Mult7 Reax 試管振蕩器 德國Heidolph 公司；DTC-27F 多功能靜音型超聲波清洗機 湖北鼎泰公司；超越系列XP 分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；CF16RN 多用途冷凍離心機 日本Himac 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取 準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品2~5 g，依次添加10 mL 0.1%甲酸水（體系pH 在2~3 之間）、10 mL 乙腈、6 g 氯化鈉、2 g 無水硫酸鎂，振蕩2 min，在10000 r/min、2 ℃條件下高速冷凍離心5 min[24?26]。離心后取全部上清液，于?18 ℃環境下保存3 h，待凈化[27]。

1.2.1.2 凈化 分別吸取經提取后的上層乙腈層各1 mL 到凈化管中，依次添加20 mg C18、50 mg PSA、150 mg 無水硫酸鎂，振蕩2 min，在5000 r/min、2 ℃條件下冷凍離心5 min。其上清液經0.22 μm 濾膜過濾后供UPLC 分析[28?29]。

1.2.2 溶液的配制和標準曲線的繪制 標準儲備溶液的配制：分別稱量氰氟草酯和氰氟草酸標準品10 mg 到10 mL 含有甲醇的容量瓶中，超聲使其充分溶解，定容，配制成1000 μg/mL 的標準儲備溶液，并在?18 ℃環境中進行貯存[30]。

混合標準使用液的配制：分別吸取100 μL 的氰氟草酯和氰氟草酸標準儲備液于1 mL 的試劑瓶中，用乙腈進行稀釋，使其成為100 μg/mL 的混合標準使用液，在低溫下放置，備用。

0.1%甲酸水的配制：準確吸取1 mL 甲酸，用超純水定容至1000 mL，低溫下放置，備用。

空白基質溶液的配制：準確稱取未檢出氰氟草酯和氰氟草酸殘留的大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品，根據1.2.1 的方法，制得空白基質溶液。

溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線繪制：分別用乙腈和空白基質溶液稀釋混合標準使用液，制得質量濃度為0.002、0.005、0.01、0.02、0.1、2、5 μg/mL的溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液，分別進樣分析，外標法定量。以質量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），繪制溶劑標準曲線和各物質的基質匹配標準曲線。

1.2.3 樣品前處理的優化

1.2.3.1 檢測樣品取樣量的選擇 分別準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品各2 g 和5 g，谷物和油料分別加標0.01 μg/mL 和0.02 μg/mL后進行前處理，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.2 提取劑的選擇 準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品加標后進行前處理，在提取過程中，選擇酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）、乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）及甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（0.5:0.5:1，V/V/V）作為提取溶劑，分別考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.3 提取體系pH 的選擇 準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品加標后進行前處理，在提取過程中，調節體系pH，分別考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。由于氰氟草酯在pH=4.0 時穩定，且根據董婷等[16]的實驗結果，萃取體系的pH 在2.5~3.0 時，可以得到較高的回收率且提取組分的雜質較少，故pH 取值1.5、2.5、3.5、4.5、5.5。

1.2.3.4 鹽析劑的選擇 準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品加標后進行前處理，在提取過程中，分別選擇氯化鈉和內容物為無水硫酸鎂和醋酸鈉的QuEChERS 萃取鹽包將水層與有機層分離，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.3.5 吸附劑的選擇 準確稱取大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品加標后進行前處理，在凈化過程中，分別選擇C18和PSA、PSA 作為吸附劑，考察氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。

1.2.4 色譜條件 在董婷等[16]研究的基礎上進行了優化，氰氟草酯和氰氟草酸得到很好的分離，出峰時間分別在7.10~7.20 min 和3.61~3.71 min，故采取以下的色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm, 1.7 μm）；流動相：A 為甲醇，B 為乙腈，C 為0.1%磷酸水溶液，采用梯度洗脫，具體見表1；流速：0.3 mL/min；進樣量：2 μL；柱溫：40 ℃；樣品溫度：15 ℃；檢測波長：248 nm。

表1 超高效液相色譜梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program of UPLC

1.2.5 回收率的測定 準確稱取未檢出氰氟草酯和氰氟草酸殘留的大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品，分別添加定量限1 倍、2 倍、10 倍質量濃度的氰氟草酯和氰氟草酸標準溶液，使用1.2.1 的方法處理后按 1.2.4 的色譜條件進行檢測，平行檢測6 次，計算加標回收率和相對標準偏差RSD（%）。

1.3 數據處理

使用Empower 3 （Waters，USA）和Origin 2017軟件采集、處理和分析數據。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理的優化

2.1.1 樣品取樣量的選擇 參考GB 23200.113-2018《食品安全國家標準植物源性食品中208 種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》，樣品取樣量一般為2.0 g 和5.0 g，故本實驗通過比較樣品取樣量在2.0 g 和5.0 g 時，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率，確定最佳的樣品取樣量。實驗表明，對于小麥、大麥、燕麥、花生和大豆樣品，取樣量為2.0 g時，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率高，取樣量為5.0 g時，提取體系過于粘稠，導致提取不充分，使得回收率降低，因此以上5 種樣品選擇取樣量為2.0 g。對于大米與玉米樣品，取樣量對待測物的回收率影響較小，由于取樣量為5.0 g 時回收率相對偏高，故選擇取樣量為5.0 g。結果見圖1。

圖1 檢測樣品取樣量的選擇Fig.1 Selection of sampling amount of test sample

2.1.2 提取劑的選擇 選擇酸化甲醇、酸化乙腈、甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）、乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）及甲醇-乙腈-0.1%甲酸水（0.5:0.5:1，V/V/V）作為提取溶劑，考察在總量保持不變的前提下，不同提取劑對提取回收率的影響。結果見圖2，提取劑為乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）時，各樣品的回收率顯然高于其余幾種，此時氰氟草酯和氰氟草酸的回收率分別為89.69%~98.00%和86.88%~96.30%，比回收率最低的甲醇-0.1%甲酸水（1:1，V/V）作為提取劑時分別高出16.68%~20.88%和15.66%~21.20%。此外，提取劑選擇乙腈比選擇甲醇的提取效果好，證實了Lehotay 等[31?33]提出的，與其他溶劑相比，乙腈對大多數化合物具有適當的極性，產生更好的回收率和相容性。故選擇乙腈-0.1%甲酸水（1:1，V/V）作為提取溶劑。

圖2 提取劑的選擇Fig.2 Selection of extractants

2.1.3 提取體系pH 的選擇 本實驗考察提取體系不同pH 對提取回收率的影響，結果見圖3，提取體系pH 在2.5 和3.5 時，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率較高，在1.5 和5.5 時較低，原因可能是，氰氟草酸在水中呈離子狀態，很難被有機溶劑提取，酸性體系可提高其提取率。趙莉等[34]的實驗也表明氰氟草酯在酸性條件下是比較穩定的，而在微酸性及中性條件下水解速度加快，在堿性條件下水解迅速。所以選擇整個萃取體系的pH 為2.5~3.5。

圖3 提取體系pH 的選擇Fig.3 Selection of the pH of the extraction system

2.1.4 鹽析劑的選擇 在提取過程中，為了得到澄清的萃取液，要通過鹽析作用使水層與乙腈層分離[35]。在本實驗中，分別選擇氯化鈉和內容物為無水硫酸鎂和醋酸鈉的QuEChERS 萃取鹽包作為鹽析劑，考察提取回收率。從圖4 可以看出，各樣品在提取過程中，使用氯化鈉作為鹽析劑的體系，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率分別為92.68%~101.11%和89.65%~99.20%，比使用QuEChERS 萃取鹽包的體系分別高出18.56%~18.88%和17.54%~20.08%。QuEChERS萃取鹽包中含有無水硫酸鎂和醋酸鈉，前者可除去樣品基質中的水分，后者可提供適宜pH，使得堿敏感的氰氟草酯和氰氟草酸能有較好的回收率，但由于體系含水量較大，鹽與水反應放熱，導致氰氟草酯和氰氟草酸分解，從而導致回收率偏低。因此，選擇氯化鈉作為鹽析劑。

圖4 鹽析劑的選擇Fig.4 Selection of salting-out agents

2.1.5 吸附劑的選擇 在本實驗中，分別選擇C18和PSA 作為吸附劑，考察同時使用PSA 和C18作為吸附劑和僅使用PSA 作為吸附劑時，各樣品氰氟草酯和氰氟草酸的提取回收率。實驗表明，吸附劑的種類對大米、玉米、燕麥、小麥和大麥中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率影響不大，但對油籽類花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率影響較大，同時使用PSA 和C18時，氰氟草酯和氰氟草酸的回收率比單獨使用PSA 時，花生分別高出9.77%和10.63%，大豆分別高出11.16%和10.74%。因為，PSA 可除去有機酸、脂肪酸、糖類等，C18可除去脂質、色素等[36?37]，在測定油籽類的花生、大豆樣品時，若不加入C18，脂質將會干擾氰氟草酯和氰氟草酸的測定，導致回收率降低。由此得出，同時測定谷物和油料樣品時，需要同時加入PSA 和C18作為吸附劑；若只測定谷物類樣品，可考慮不加C18。由于本實驗需要同時測定谷物類和油籽類樣品，故選擇PSA 和C18同時作為吸附劑。結果見圖5。

圖5 吸附劑的選擇Fig.5 Selection of adsorbents

2.2 基質效應、線性關系、檢出限和定量限

樣品中存在與目標化合物結構、性質相似的基質成分，在樣品制備過程中也會被提取出來，這些基質成分會干擾分析過程，影響結果準確性，這種現象便是基質效應[38]。實驗中以ME（%）=（1?K1/K2）×100計算基質效應[39]，其中，ME 為基質效應，K1為基質匹配標準曲線的斜率，K2為溶劑標準曲線的斜率。根據1.2.2，用乙腈和7 種樣品的空白基質溶液分別稀釋氰氟草酯和氰氟草酸的混合標準使用液，得到溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線。以3 倍信噪比（S/N≥3）和10 倍信噪比（S/N≥10）分別確定檢出限（LOD）與定量限（LOQ）[30]。

結果見表2，在乙腈、大米、小麥、大麥、玉米、燕麥、花生、大豆中，氰氟草酸和氰氟草酯在0.002~5 μg/mL 的濃度范圍的峰面積與質量濃度間呈良好的線性關系，相關系數（r）都大于0.9987。7 種樣品的基質效應都在0~20%之間，說明基質效應對定量檢測的影響不顯著，可以忽略[24,40]。檢出限（LOD）在0.002~0.005 mg/kg 之間，定量限（LOQ）在0.01~0.02 mg/kg 之間。

表2 氰氟草酯和氰氟草酸的線性方程、相關系數、基質效應、檢出限、定量限Table 2 The linear equation, correlation coefficient, matrix effect, detection limit, quantification limit of cyhalofop-butyl and cyhalofop-acid

2.3 方法的回收率與精密度

取未檢出農藥殘留的大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、大豆和花生樣品，分別添加定量限1 倍、2 倍、10 倍質量濃度的氰氟草酯和氰氟草酸標準溶液，即谷物添加濃度為0.01、0.02、0.1 μg/mL，油籽添加濃度為0.02、0.04、0.2 μg/mL，使用1.2.1 的方法處理后按 1.2.4 的色譜條件進行檢測，平行檢測6 次。結果見表3，大米、玉米、燕麥、小麥和大麥中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范圍為89.23%~101.12%和87.98%~100.02%，空白基質和加標樣品譜圖見圖6和圖7（以玉米為例）；花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范圍為85.12%~92.34%和82.63%~89.55%，空白基質和加標樣品譜圖見圖8 和圖9（以花生為例）；所有樣品的相對標準偏差（RSD）為1.1%~3.3%。該方法的準確性和重復性良好。

圖6 玉米空白譜圖Fig.6 Blank spectrum of corn

圖7 玉米添加樣品譜圖（0.01 μg/mL）Fig.7 Spectra of corn added samples (0.01 μg/mL)

圖8 花生空白譜圖Fig.8 Blank spectrum of peanut

圖9 花生添加樣品譜圖（0.02 μg/mL）Fig.9 Spectra of peanut added samples (0.02 μg/mL)

表3 氰氟草酯和氰氟草酸的添加回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Addition recovery rate and relative standard deviation of cyhalofop-butyl and cyhalofop-acid (n=6)

2.4 實際樣品測定

隨機抽取新疆維吾爾自治區博爾塔拉蒙古自治州大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、花生和大豆樣品各20 份進行檢測，結果見表4?？梢钥闯?，7 種樣品中，氰氟草酯在大米、玉米、小麥、大麥和大豆中均有檢出，檢出率在10%~45%之間，平均殘留量在0.0026~0.0079 mg/kg 之間，燕麥和花生樣品均未檢出；氰氟草酸在大米、小麥、大麥和大豆中均有檢出，檢出率在5%~40%之間，平均殘留量在0.0029~0.0062 mg/kg 之間，玉米、燕麥和花生樣品均未檢出。本實驗中，谷物類樣品的氰氟草酯最大殘留量為0.0093 mg/kg，氰氟草酸最大殘留量為0.0085 mg/kg；油籽類樣品的氰氟草酯最大殘留量為0.0089 mg/kg，氰氟草酸最大殘留量為0.0084 mg/kg，均小于我國和歐盟對谷物及油籽的限量規定。部分樣品的色譜分析圖見圖10。

表4 氰氟草酯和氰氟草酸在7 種樣品中的檢出率及濃度范圍Table 4 Detection rate and concentration range of cyhalofop butyl and cyhalofop-acid in 7 samples

圖10 實際樣品譜圖Fig.10 Spectra of practical samples

3 結論

本研究通過優化QuEChERS 前處理方法和分析基質效應對測定氰氟草酯和氰氟草酸殘留量的影響，使用UPLC 分析檢測，外標法定量，建立了一種能同時檢測植源性食品中氰氟草酯和氰氟草酸殘留量的方法。在乙腈和7 種樣品中，氰氟草酸和氰氟草酯在0.002~5 μg/mL 的濃度范圍內的峰面積與質量濃度間呈良好的線性關系，相關系數（r）都大于0.9987。大米、玉米、燕麥、小麥和大麥中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范圍為89.23%~101.12%和87.98%~100.02%，檢出限為0.002 mg/kg，定量限為0.01 mg/kg；花生和大豆中氰氟草酯和氰氟草酸的回收率范圍為85.12%~92.34%和82.63%~89.55%，檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg；所有樣品的相對標準偏差（RSD）為1.1%~3.3%。該方法在實際檢測中具有較強的可行性和實用性，可以滿足谷物類和油籽類樣品中氰氟草酯和氰氟草酸的監測要求。

該檢測方法的前處理過程較二氯甲烷萃取法等更加簡單、快速，并且能同時檢測谷物和油籽中氰氟草酯和氰氟草酸的殘留量，靈敏度和準確度達到了農殘檢測的要求，是一種高效的方法，適用于氰氟草酯和氰氟草酸在谷物及油籽中的日常檢測。此外，對于其它與大米、玉米、燕麥、小麥、大麥、花生和大豆具有相似化學成分的食品中的氰氟草酯和氰氟草酸殘留研究具有參考意義。