益生菌發(fā)酵刺麒麟菜制備硫酸多糖工藝優(yōu)化及性質(zhì)分析

張 軍，谷福蝶，劉 艷，周 鈺，劉慶梅,2，劉光明,

（1.集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院，福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361021；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院，疑難重癥及罕見病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100005）

近年來，海洋藻類作為豐富且重要的海洋生物資源，因含有糖類、多酚、蛋白質(zhì)等豐富的天然活性物質(zhì)，被廣泛報(bào)道[1?2]。據(jù)《2021 中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2020 年我國麒麟菜養(yǎng)殖產(chǎn)量高達(dá)3856 噸，同比2019 年增長818%。刺麒麟菜（Eucheuma spinosum）屬于紅藻綱，紅翎菜科，是生產(chǎn)卡拉膠的主要原材料，其富含的硫酸多糖在卡拉膠加工過程中一直被當(dāng)作廢棄物處理[3]。但硫酸基團(tuán)被認(rèn)為是酸性多糖主要的活性基團(tuán)，硫酸多糖也被證實(shí)具有更高的生物活性[4]，因此富含硫酸基團(tuán)的刺麒麟菜硫酸多糖在食品工業(yè)與醫(yī)藥領(lǐng)域具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

刺麒麟菜硫酸多糖的物理制備方式以熱水浸提和低溫凍融為主，常輔以超聲破碎處理以提高得率，低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖（Low temperature freeze-thawEucheuma spinosumsulfate polysaccharide，L-ESP）對比熱提多糖粘度降低，溶解性提高，硫酸基團(tuán)保護(hù)較好，但依舊存在著分子量大、生物利用度低等問題，往往給進(jìn)一步加工利用帶來困難。因此，刺麒麟菜硫酸多糖制備方式的開發(fā)備受關(guān)注。

益生菌不僅可以生產(chǎn)健康的發(fā)酵食品[5]，益生菌與膳食互作更是被定為2020 年益生菌科學(xué)研究十大熱點(diǎn)之一[6]。有研究報(bào)道，采用益生菌發(fā)酵得到的多糖，生物活性物質(zhì)溶出率顯著提升，分子量降低，更易被腸道吸收[7?8]，其生物活性也優(yōu)于未發(fā)酵多糖[9?11]。鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）是一種益生菌菌株，常作為乳品[12]、飲料[13]、保健食品或飼料的原料或發(fā)酵劑被廣泛使用。Wu 等[14]利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵四種海藻，發(fā)現(xiàn)得到的海藻低聚糖（SwOSLAFP）顯示出更大的還原能力和亞鐵離子螯合能力以及對過氧化氫的清除能力，抗氧化活性顯著提高。綜上所述，益生菌發(fā)酵已經(jīng)應(yīng)用于天然多糖的制備，但刺麒麟菜多糖的發(fā)酵制備工藝、性質(zhì)特征、抗過敏活性以及相關(guān)的構(gòu)效關(guān)系尚不明確。

因此本文利用鼠李糖乳桿菌發(fā)酵刺麒麟菜制備發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖（FermentedEucheuma spinosum、 sulfate polysaccharide，F(xiàn)-ESP），借助Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化制備條件，并對其化學(xué)成分、物理性質(zhì)和官能團(tuán)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步解析，通過大鼠嗜堿性粒細(xì)胞（Rat Basophilic Leukemia-2H3，RBL-2H3）經(jīng)典脫顆粒模型初步評價(jià)其抗過敏活性，旨在為刺麒麟菜多糖工業(yè)化生產(chǎn)和功能食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，為刺麒麟菜的高值化利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺麒麟菜 綠新（福建）食品有限公司；鼠李糖乳桿菌（BNCC185356） 北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；RBL-2H3 細(xì)胞 上海復(fù)祥生物技術(shù)有限公司；MEM 液體培養(yǎng)基 美國HyClone 公司；胎牛血清 美國Gemini 生物科技公司；臺(tái)氏緩沖液（PB180338） 武漢普諾賽生命科技有限公司；MRS培養(yǎng)基、DEAE-52 纖維素 北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白檢測試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒 廈門鱟試劑生物科技股份有限公司；MTT、β-氨基己糖苷酶底物、抗二硝基苯單克隆抗體小鼠抗 美國sigma 公司；DNPBSA 基因生物技術(shù)國際貿(mào)易（上海）有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

InfiniteM200PRO 酶標(biāo)儀 德國Tecan 公司；NP80 紫外分光光度計(jì) 德國IMPLEN 公司；內(nèi)徑0.7~0.8 mm 烏氏粘度計(jì) 上海寶山啟航玻璃儀器廠；Waters 2695 型高效液相色譜 美國Waters 公司；Forma3111 水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；SG-403 生物安全柜 美國Baker 公司；Nunc細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Thermo 公司；PhenomPro 臺(tái)式掃描電鏡 美國Phenomworld 公司；ALPHA 傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖的制備 刺麒麟菜淘洗去除泥沙后于50 ℃烘箱烘干，將干燥后的刺麒麟菜剪碎放入破壁機(jī)粉碎過100 目篩，置于保鮮盒存放于陰涼干燥處待用。參考Zhang 等[15]的方法稍作修改，將刺麒麟菜菜粉按照一定料液比與超純水混合后，加入2.5%（w/w）的果葡糖漿，然后121 ℃高溫滅菌20 min，冷卻至室溫后加入適量已活化的鼠李糖乳桿菌，于37 ℃厭氧發(fā)酵，然后100 ℃滅活10 min，于室溫下8000 r/min 離心10 min，收集上清。加入4 倍體積的無水乙醇，4 ℃靜置過夜，8000 r/min 離心10 min 得到沉淀，將沉淀復(fù)溶于超純水，冷凍干燥后，即得到發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖。參考陳玉芳等[16]的方法，將刺麒麟菜粉和超純水按照料液比1:90 混合，?18 ℃冷凍2 h，解凍溫度55 ℃，反復(fù)凍融三次，制備冷凍刺麒麟菜多糖作為后續(xù)樣品對照。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取刺麒麟菜10 g，固定接菌量為4%（v/v），發(fā)酵時(shí)間為24 h，探究料液比（w/v）為1:40、1:50、1:60、1:70，1∶80 時(shí)對粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、發(fā)酵時(shí)間為24 h，探究接菌量為0.5%、1%、2%、4%、8%時(shí)對粗多糖得率的影響；固定料液比1:70、接菌量4%，探究發(fā)酵6、12、18、24、30 h 時(shí)對粗多糖得率的影響。粗多糖得率以凍干粗多糖質(zhì)量與菜粉質(zhì)量之比計(jì)算。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、接菌量、發(fā)酵時(shí)間為自變量，以發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率為響應(yīng)值，以Box-Benhnken 設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見表1），用Design Expert 12 軟件擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，分析回歸方程從而預(yù)測最優(yōu)工藝參數(shù)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素及水平Table 1 Factors and level of response surface test design

1.2.4 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化 按照最佳工藝發(fā)酵得到發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖后，取1 g 按10 mg/mL 復(fù)溶于超純水，上樣于預(yù)裝20 g 的DEAE Cellulose-52 的直徑2.5 cm 的層析柱，恒流泵流速設(shè)置為2 mL/min，依次用0、0.5、1、2 mol/L 的氯化鈉溶液階段洗脫，每管收集5 mL。蒽酮硫酸比色法測定每管洗脫液在630 nm 處的吸光度，并做出洗脫曲線，收集糖含量較高的部分，3 kDa 透析膜透析72 h，冷凍干燥機(jī)凍干，即得到發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖F-ESP；低溫凍融刺麒麟菜硫酸多糖L-ESP 純化方式同上。

1.2.5 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學(xué)組成分析 按照Zhang 等[17]的方法進(jìn)行單糖組成分析；以半乳糖為標(biāo)準(zhǔn)品，利用蒽酮硫酸顯色法[18]對純化后的發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖和低溫凍融刺麒麟菜多糖的總糖含量進(jìn)行測定；參考趙凱等[19]的方法，利用3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量；硫酸根含量參考Yu 等[20]以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Dodgson-Price 法[21]進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)含量參考Tang 等[22]采用碧云天BCA 蛋白檢測試劑盒進(jìn)行測定；利用鱟試劑內(nèi)毒素檢測試劑盒檢測內(nèi)毒素含量。

1.2.6 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質(zhì)分析

1.2.6.1 平均分子量的測定 參照Gong 等[23]的方法利用高效凝膠滲透法（HPGPC），采用示差檢測器，配制pH 為6 的20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按照2%（w/v）的濃度溶于磷酸鹽緩沖液，分別進(jìn)樣于TSK-GELG4000 SWXL 色譜柱，流速為0.4 mL/min，進(jìn)樣體積20 μL，對兩種多糖樣品的純化產(chǎn)物的平均分子量進(jìn)行測定。

1.2.6.2 溶解度的測定 稱取純化后的凍干樣品200 mg 置于烘干至恒重的15 mL 離心管中，加入10 mL 超純水混合，室溫下振蕩30 min，使多糖樣品充分溶解，將樣液全部轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，定容至刻度線后混勻。吸取10 mL 于8000 r/min 離心10 min，將上清液完全轉(zhuǎn)入稱量瓶中烘干，恢復(fù)至室溫后稱重。按照式（1）計(jì)算：

式中：DSI 溶解度（%）；m0樣品質(zhì)量（g）；m1稱量瓶質(zhì)量（g）；m2烘干樣品+瓶質(zhì)量（g）。

1.2.6.3 比濃粘度的測定 在25 ℃恒溫條件下，使用內(nèi)徑為0.7~0.8 mm 的烏氏粘度計(jì)測定濃度為0.5 g/dL 的L-ESP 和F-ESP 的比濃粘度（ηre），參照Liu 等[24]的方法進(jìn)行，每個(gè)樣品獨(dú)立測定5 次，分別記錄樣液通過毛細(xì)管的時(shí)間，按照式（2）計(jì)算：

式中：t0純水流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間（s）；t 樣品流經(jīng)毛細(xì)管的時(shí)間（s）；η0純水的粘度；ηr相對粘度；ηsp特性粘度；ηre比濃粘度（dL/g）；C 樣品濃度（g/dL）。

1.2.6.4 掃描電鏡分析 將多糖樣品固定在載物臺(tái)導(dǎo)電膠表面，將載物臺(tái)轉(zhuǎn)移至蒸金室，打開真空泵，達(dá)到真空度后，濺射儀噴金90 s，然后在放大倍數(shù)為500×、1000×、3000×條件下進(jìn)行拍照，觀察多糖樣品的微觀形貌。

1.2.7 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析 將樣品與干燥的溴化鉀以1:100 比例混合后研磨，經(jīng)手動(dòng)壓片后利用傅里葉紅外光譜儀在400~4000 cm?1進(jìn)行掃描[25]。

1.2.8 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖抗過敏活性評價(jià)RBL-2H3 細(xì)胞使用10% FBS-MEM 在5% CO2，37 ℃下培養(yǎng)，并采用MTT 試劑按照說明書檢測不同濃度樣品對細(xì)胞活力的影響；RBL-2H3 細(xì)胞脫顆粒參考Zhang 等[26]的方法，將RBL-2H3 細(xì)胞計(jì)數(shù)后用10%的FBS-MEM 稀釋，按照5×104個(gè)/孔鋪至96 孔培養(yǎng)板，用終濃度0.1 μg/mL 的anti-DNP-IgE 敏化過夜，然后PBS 洗滌一次，樣品組加入不同濃度樣品（10、25、50、100 μg/mL）的臺(tái)氏緩沖液100 μL 孵育1 h，然后向陽性組和樣品組加入終濃度為0.5 μg/mL的DNP-BSA 激發(fā)，陰性孔加入同體積的PBS 緩沖液，1 h 后收集上清，向板底加入含有0.1% TritionX-100 的臺(tái)氏緩沖液100 μL，裂解5 min，吹打均勻后吸取上清和裂解液各25 μL，置于黑色熒光板，加入100 μL 1.2 mmol/mL 的β-氨基己糖苷酶底物，混勻后37 ℃孵育30 min，檢測激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長450 nm 條件下的吸光度值。β-氨基己糖苷酶抑制率按照式（3）、（4）計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)三次以上，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。采用SPSS 20.0 軟件中的圖基檢驗(yàn)（Tukeytest）進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極其顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1A 所示，料液比不斷增大，粗多糖得率呈現(xiàn)先快速增長后平緩的趨勢，分析是因?yàn)榱弦罕仍龃髮?dǎo)致內(nèi)外滲透壓以及溶液飽和度的變化，當(dāng)料液比為1:40 時(shí)溶液極易達(dá)到飽和，且粘稠度高，不易于多糖的進(jìn)一步析出，當(dāng)液體體積不斷增大至1:80，刺麒麟菜粉末與發(fā)酵液接觸面積增大，多糖溶出率也隨之上升，到達(dá)工藝上限。但料液比為1:70 和1:80 時(shí)，多糖得率差異不顯著（P>0.05），因此選擇1:70 作為后續(xù)試驗(yàn)條件。

圖1B 所示，得率隨著接菌量的增大逐漸升高，接菌量為4%時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)擴(kuò)大至8%時(shí)，得率明顯下降，分析是因?yàn)槭罄钐侨闂U菌能夠以刺麒麟菜中某些糖類為碳源，利用了一部分可代謝的糖，從而導(dǎo)致最終得率的下降，這也印證了刺麒麟菜可能具有益生元特性，也有大量文獻(xiàn)對此進(jìn)行了報(bào)道[27?29]。

圖1 料液比（A）、接菌量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）對發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-liquid ratio(A), inoculation amount(B) and fermentation time(C) on the yield of F-ESP

刺麒麟菜皮層最外2~3 層多為小型薄壁細(xì)胞，內(nèi)容物較少，向內(nèi)逐漸增大[30]，而發(fā)酵前期主要分解了外側(cè)小型薄壁細(xì)胞的初生壁，隨著發(fā)酵時(shí)間增長，內(nèi)層較大的薄壁細(xì)胞被分解，大量內(nèi)容物析出，得率顯著提高，如圖1C 所示，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間不斷增長至30 h時(shí)得率達(dá)到峰值，但與24 h 差異不顯著（P>0.05）。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖制備工藝

響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù) Box-Benhnken 原理利用DesignExpert 12 軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，稱量凍干后的所有固形物并計(jì)算多糖得率，結(jié)果如表2 所示。

采用Design-Expert 12 軟件對表2 結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到多糖得率對料液比（A）、接菌量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)式回歸模型：

表2 發(fā)酵制備刺麒麟菜硫酸多糖響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface for preparation of F-ESP

Y= 40.00+2A+2.03B+0.6038C?1.75AB?1.87AC?0.0475BC?3.49A2?4.71B2?2.04C2

如表3 所示，相關(guān)系數(shù)R2為模型與總和的比值=272.80/281.95=0.9675，表示模型擬合性能良好，且失擬檢驗(yàn)P值大于0.05，表明模型未失擬，模型P值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于0.05，說明各因素與響應(yīng)值的線性關(guān)系十分顯著，模型F值為23.20，說明該模型有意義，上述結(jié)果表明回歸二次模型建立成功，可用于評價(jià)發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的工藝條件。根據(jù)ANOVA 分析數(shù)據(jù)差異項(xiàng)，接菌量和液料比的變化對多糖得率的影響顯著差異（P＜0.01），根據(jù)各因素的F值判斷主次因素并進(jìn)行排序：接菌量>液料比>發(fā)酵時(shí)間。綜合上述數(shù)據(jù)和分析，擬合出發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖最佳工藝條件為料液比1:72.3、接菌量5.5%、發(fā)酵時(shí)間24.2 h，預(yù)測值為40.41%。為便于操作，條件參數(shù)設(shè)置為料液比1:70，接菌量5%，發(fā)酵時(shí)間24 h，按照該條件獨(dú)立重復(fù)制備三次的粗多糖得率均值為41.70%±2.0%，與預(yù)測值相符合，且顯著大于凍融法的得率（33.52%±2.71%）。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

如圖2 所示，響應(yīng)曲面映射在等高線上的圖形越接近橢圓表明差異越顯著，越接近圓越不顯著。

圖2 各因素對發(fā)酵刺麒麟菜粗多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface diagram and contour map of the interaction of various factors on the yield of F-ESP注：A 為料液比-發(fā)酵時(shí)間，B 為接菌量-料液比，C 為發(fā)酵時(shí)間-接菌量。

根據(jù)表3 和圖2A 結(jié)合判斷，料液比和發(fā)酵時(shí)間相互作用顯著（P＜0.05），分析可能是因?yàn)榱弦罕纫欢〞r(shí)，發(fā)酵時(shí)間的增加導(dǎo)致多糖的逐漸溶出，使得多糖得率先增加再平緩，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間一定時(shí)，料液比同樣決定了多糖的溶出量以及刺麒麟菜纖維內(nèi)部和溶液的濃度差；圖2B 可以看出料液比與接菌量的響應(yīng)曲面較陡峭，結(jié)合表3 中可知AB 交互項(xiàng)對多糖得率的影響顯著（P＜0.05），說明料液比與接菌量的交互作用對多糖得率影響較大；接菌量和發(fā)酵時(shí)間的等高線圖曲面比較平緩（圖2C），交互作用不顯著（P>0.05）。

2.3 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的分離純化

如圖3 所示，圖3A 為凍融法制備的L-ESP 洗脫曲線，圖3B 為鼠李糖乳桿菌發(fā)酵制備的F-ESP 洗脫曲線，將兩種粗多糖上樣于DEAE-52 層析柱，經(jīng)過0、0.5、1、2 mol/L 的NaCl 溶液階段洗脫，測定總糖含量繪制洗脫曲線，各得到3 個(gè)組分，命名為LESP-1、L-ESP-2、L-ESP-3，F(xiàn)-ESP-1、F-ESP-2、FESP-3。據(jù)報(bào)道硫酸根的存在能夠顯著提高植物多糖的生物活性[31]，因此對三個(gè)組分的硫酸根含量進(jìn)行測定，并結(jié)合得率選取L-ESP-3 和F-ESP-3 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品。

圖3 L-ESP（A）和F-ESP（B）的DEAE-52 洗脫曲線Fig.3 DEAE-52 elution curves of L-ESP (A) and F-ESP(B)

2.4 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的化學(xué)成分分析

將L-ESP-3 與F-ESP-3 經(jīng)三氟乙酸水解后還原乙酰化得到用于檢測的糖醇乙酰酯衍生物，利用氣相色譜法進(jìn)行單糖組成的檢測。取九個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品混合處理后測得標(biāo)品的氣相色譜圖，如圖4 所示，與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間對比發(fā)現(xiàn)：L-ESP-3 主要成分為半乳糖（91.14%）、含少量木糖（1.53%）與葡萄糖（7.33%），F(xiàn)-ESP-3 在儀器精度范圍內(nèi)只檢出半乳糖，未檢出其他單糖。說明鼠李糖乳桿菌發(fā)酵消耗了葡萄糖并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為半乳糖，改變了F-ESP-3 的單糖組成。Gao 等[32]同樣發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌發(fā)酵使苦瓜中葡萄糖含量降低，半乳糖含量升高。

圖4 L-ESP-3 及F-ESP-3 單糖組成的氣相色譜圖Fig.4 GC of monosaccharide composition of L-ESP-3 and F-ESP-3注：標(biāo)準(zhǔn)品：1.鼠李糖，2.巖藻糖，3.阿拉伯糖，4.木糖，5.甘露糖，6.葡萄糖，7.半乳糖，8.葡萄糖醛酸，9.半乳糖醛酸。

如表4 所示，L-ESP-3 與F-ESP-3 的總糖含量均達(dá)到98%左右，證明兩種方法均得到了純度較高的刺麒麟菜硫酸多糖，F(xiàn)-ESP-3 的還原糖含量為7.87%±0.09%較L-ESP-3（1.45%±0.10%）極顯著提升（P＜0.01）；二者硫酸根含量分別為28.76%±2.23%和28.40%±1.40%，硫酸根結(jié)構(gòu)均未被破壞，說明這兩種方法均能夠保護(hù)多糖的硫酸根。同時(shí)發(fā)酵法還提高了刺麒麟菜硫酸多糖中還原糖的比例，乳酸菌發(fā)酵的酸性環(huán)境有效去除一部分蛋白質(zhì)，且內(nèi)毒素含量小于0.03 EU/mg，符合中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)[33]。

表4 刺麒麟菜硫酸多糖化學(xué)組成成分表Table 4 Chemical composition ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.5 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的物理性質(zhì)分析

分子量測定結(jié)果如圖5 所示，L-ESP-3 分子量大于670 kD，與陳玉芳等[16]得到的刺麒麟菜多糖分子量相似（690.12 kD）；F-ESP-3 的分子量為33.58 kD明顯降低，分析可能是因?yàn)槭罄钐侨闂U菌屬于乳酸菌，乳酸菌在代謝過程中可以產(chǎn)生大量胞外酶系，如纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等，這些非特異性酶能夠隨機(jī)降解多糖糖苷鍵[34]。同時(shí)也有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為發(fā)酵的酸性環(huán)境能夠使復(fù)雜多聚糖水解為低聚糖，導(dǎo)致分子量進(jìn)一步降低[35]。孫菁雯[36]利用發(fā)酵復(fù)合酶解法制備的銅藻和龍須菜多糖＜3 kD 的組分含量上升，表明多糖被降解，本研究獲得了相似的結(jié)果。

圖5 刺麒麟菜硫酸多糖的分子量分布圖Fig.5 Molecular weight distribution of sulfated polysaccharides fromEucheuma spinosum

經(jīng)計(jì)算，L-ESP-3 溶解度為56.51%±3.8%，F(xiàn)-ESP-3 的溶解度為89.33%±3.1%；L-ESP-3 和F-ESP-3 的比濃粘度分別為3.85±0.25 dL/g 和0.01±0.002 dL/g（P＜0.01），由此可知，益生菌發(fā)酵法制備的刺麒麟菜多糖黏度極顯著降低，溶解度極顯著提高。有研究表明聚合物溶液的粘度較高的原因在于當(dāng)分子鏈長度遠(yuǎn)大于溶劑分子，加上溶劑化作用，使其在流動(dòng)時(shí)受到較大的內(nèi)摩擦阻力，分子量大，分子鏈纏結(jié)越嚴(yán)重，使流動(dòng)阻力變大，粘度升高[37]。所以分子量的降低可能是F-ESP 黏度降低的主要影響因素。

如圖6 所示，L-ESP-3 的微觀結(jié)構(gòu)整體呈片狀，3000 倍放大后，可以看到結(jié)構(gòu)非常完整且表面光滑致密，而F-ESP-3 微觀結(jié)構(gòu)截然不同，呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，3000 倍放大后，發(fā)現(xiàn)表面粗糙有裂紋，內(nèi)部結(jié)構(gòu)具有大量孔隙。刺麒麟菜多糖作為卡拉膠多糖的一種，屬于天然高分子凝膠，有研究報(bào)道，天然高分子凝膠的表面粗糙度增加可能是因?yàn)樘擎滈g一般通過氫鍵連接，當(dāng)糖苷鍵斷裂后，導(dǎo)致糖鏈間氫鍵交聯(lián)密度變小，疇結(jié)構(gòu)變大[38]。

圖6 刺麒麟菜硫酸多糖的掃描電鏡圖Fig.6 Scanning electron microscope picture ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharide

2.6 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜分析

如圖7 所示，在特征譜帶區(qū)3450 cm?1為O-H的伸縮振動(dòng)，2923 cm?1為C-H 的伸縮振動(dòng)[39]，這部分為多糖類的特征吸收，1641 cm?1為C=O 的特征吸收[40]，在指紋區(qū)1249 cm?1為O=S=O 的伸縮振動(dòng)，說明該多糖含有硫酸酯基[41]，在1071cm?1處的特征吸收說明在主鏈中存在吡喃半乳糖，929 cm?1為C-O 上的3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基的特征吸收[42]；846 cm?1為吡喃糖環(huán)C4 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，成苷的半縮醛羥基為α構(gòu)型[44]，804 cm?1為吡喃糖環(huán)C2 上的C-O-SO3的特征吸收[43]，這與ι-卡拉膠的特征光譜相似[45]。綜上所述，兩種方式制備的多糖結(jié)構(gòu)相似，發(fā)酵并未改變多糖的糖鏈結(jié)構(gòu)，F(xiàn)ESP-3 是一種含3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基的α硫酸吡喃糖。

圖7 刺麒麟菜硫酸多糖的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectra ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides

2.7 發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖的抗過敏活性評價(jià)

如圖8 所示，在10~400 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，LESP-3 和F-ESP-3 均無明顯細(xì)胞毒性，且RBL-2H3細(xì)胞活力均在90%以上，說明對細(xì)胞活力無顯著影響（P>0.05）。

圖8 刺麒麟菜硫酸多糖對RBL-2H3 細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effect of polysaccharide sulfate fromEucheumaspinosumon the viability of RBL-2H3 cells

肥大細(xì)胞在效應(yīng)階段受到致敏原刺激后脫顆粒，β-氨基己糖苷酶的大量釋放是肥大細(xì)胞脫顆粒的經(jīng)典標(biāo)志，可以引發(fā)體內(nèi)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，而抑制β-氨基己糖苷酶釋放可以有效緩解過敏癥狀[46]。大鼠嗜堿性粒細(xì)胞與肥大細(xì)胞相似，受抗原刺激同樣釋放β-氨基己糖苷酶，并被廣泛用作在細(xì)胞水平上研究過敏反應(yīng)的替代和可靠模型[47]。如表5 所示，L-ESP-3 和F-ESP-3 兩個(gè)樣品組均可以抑制β-氨基己糖苷酶的釋放，抑制率均大于30%，呈濃度依賴，但F-ESP-3 較L-ESP-3 展現(xiàn)出更好的抑制活性，說明發(fā)酵刺麒麟菜硫酸多糖通過抑制β-氨基己糖苷酶的釋放進(jìn)一步發(fā)揮抗過敏活性。

表5 刺麒麟菜硫酸多糖抑制β-氨基己糖苷酶釋放的活性評價(jià)Table 5 The activity ofEucheuma spinosumsulfate polysaccharides in inhibiting the release ofβ-hexosaminidase

3 結(jié)論與討論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵制備刺麒麟菜粗多糖最佳條件為：料液比1:70，接菌量5%，發(fā)酵時(shí)間24 h，主次因素排序?yàn)榻泳?液料比>發(fā)酵時(shí)間，最佳條件下粗多糖得率為41.70%±2.00%；純化后的F-ESP-3 總糖含量為97.77%±1.1%，主要單糖成分為半乳糖，硫酸根含量為28.40%±1.40%，F(xiàn)-ESP-3 還原糖含量（7.87%±0.09%）對比L-ESP-3 的還原糖含量（1.45%±0.10%）極顯著提高（P＜0.01）；F-ESP-3 分子量（33.58 kD）較L-ESP-3（>670 kD）極顯著降低（P＜0.01），溶解度為（89.33%±3.1%）對比L-ESP-3 的溶解度（56.51%±3.8%）極顯著提高（P＜0.01），在相同濃度下，F(xiàn)-ESP-3 的比濃粘度為（0.01±0.002 dL/g）對比L-ESP-3 的比濃粘度（3.85±0.25 dL/g）極顯著降低（P＜0.01）；二者在微觀形態(tài)上，L-ESP-3 呈現(xiàn)均勻片狀結(jié)構(gòu)，表面光滑結(jié)構(gòu)致密，而F-ESP-3 呈現(xiàn)不規(guī)則顆粒狀，表面粗糙且內(nèi)部具有孔隙結(jié)構(gòu)；紅外結(jié)構(gòu)上二者較為相似，均含有硫酸酯基和3,6 內(nèi)醚半乳糖殘基，成環(huán)方式為α構(gòu)型吡喃糖環(huán)，指紋區(qū)呈現(xiàn)ι-卡拉膠型多糖的特征吸收。同時(shí)F-ESP-3 的β-氨基己糖苷酶抑制活性高于L-ESP-3，呈濃度依賴。

綜上所述，鼠李糖乳桿菌發(fā)酵的方式并沒有破壞多糖的鏈環(huán)結(jié)構(gòu)和硫酸基團(tuán)，因?yàn)槎嗵堑姆肿恿亢臀⒂^結(jié)構(gòu)的疏松多孔化，導(dǎo)致多糖骨架鏈間的氫鍵相互作用改變，親水基團(tuán)外露，分散性能提高，從而提高溶解度，降低粘度。同時(shí)，分子量的降低進(jìn)一步提高了F-ESP-3 透過細(xì)胞膜的能力，提高了生物利用度，從而更好地抑制RBL-2H3 細(xì)胞釋放β-氨基己糖苷酶，展現(xiàn)出良好的抗過敏活性。由于發(fā)酵多糖的糖苷鍵連接方式、空間構(gòu)象、取代基團(tuán)之間的非共價(jià)相互作用及抗過敏具體作用機(jī)理尚不清楚，因此對于發(fā)酵多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)和抗過敏活性之間的關(guān)系以及抗過敏作用靶點(diǎn)還需要進(jìn)一步深入研究。