積雪草苷通過TGF-β/Smads通路對BMSCs成骨分化的影響

曹振宇 沈曉鐘 馬建武 鄭峰

青海省人民醫院骨科，青海 西寧 810000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是骨質質量和微結構的惡化，導致骨組織脆性增加，從而提高骨折發生幾率[1]。研究表明，OP患者的骨流失是骨形成減少和骨吸收增加引起的，成骨分化形成可受多種轉錄因子和信號通路的調控[2-3]。近年來，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)因其具有強大分化能力而成為治療OP的一個很有前途的工具細胞[4]。BMSCs是典型的具有自我更新能力的間充質干細胞，可分化為成骨細胞，可能是骨組織工程的潛在細胞來源，因此，誘導BMSCs成骨分化對于骨再生應用與臨床上治療OP具有重要意義[5-6]。

積雪草是一種傘形科積雪草屬植物，積雪草苷是從積雪草中提取的一種白色針狀結晶物，主要成分是三萜皂苷[7]。積雪草苷長期以來被認為是一種傷口愈合劑，同時具有抗炎、抗纖維化、促進創傷愈合、抑制瘢痕形成、抗腫瘤、免疫調節等作用[8]。積雪草苷已被證明對細胞成骨分化有顯著的積極影響[9]，有研究發現積雪草苷通過TGF-β/Smad通路抑制增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成，對糖尿病相關認知功能障礙具有保護作用[10]。但未發現有關積雪草苷誘導BMSCs成骨分化作用的相關研究。因此，本實驗通過TGF-β/Smads通路研究積雪草苷能否促進BMSCs成骨分化，為臨床上治療OP提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞：BMSCs購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2試劑：積雪草苷購自北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%；CCK-8試劑購自上海碧云天生物技術有限公司；TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3和β-actin抗體均購自艾博抗(上海)貿易有限公司；ALP、OPN和OCN引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Annexin V-APC/PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司；一步法RT-qPCR試劑盒購自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.1.3儀器：Infinite M200酶標儀(瑞士帝肯)、CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)、多功能凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)、蛋白質電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Cytoflex流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養：將BMSCs置于完整的培養基(L-DMEM培養基+10%胎牛血清+1%青鏈霉素雙抗)。細胞培養條件為37 ℃，5%CO2。當細胞融合度達到80%～90%時，按1∶2的比例進行消化傳代2～3代，待細胞進入生長對數期后備用，細胞培養代數不能超過10代。

1.2.2細胞毒性實驗：取生長對數期的BMSCs消化重懸，將100 μL細胞懸液(1×104個/mL)加入96孔板。在5% CO2、37 ℃條件下培養12 h，然后用不同濃度的積雪草苷(0、5、10、20、30、40 μmoL/L)處理，每個濃度設3個重復孔，培養48 h。培養完成后在每個孔中加10 μL CCK 8試劑。孵育2 h后，用酶標儀測定每組細胞在450 nm波長下的OD值。

1.2.3細胞凋亡檢測：取生長對數期的BMSCs消化重懸，以5×105個/mL濃度種植至6孔板中，在5% CO2、37 ℃條件下培養過夜，然后用不同濃度的積雪草苷(0、5、10、20、30、40 μmoL/L)處理，每個濃度設3個重復孔，培養48 h，收集細胞，按試劑盒說明書操作，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.4細胞分組：機制探索實驗分成兩部分，第一部分分成2組：空白對照組與積雪草苷組(20 μmoL/L)；第二部分分成3組：空白組對照組、積雪草苷組(20 μmoL/L)與抑制組(20 μmoL/L積雪草苷+50 moL/L SB-431542)。

1.2.5細胞成骨分化檢測：將BMSCs按1.2.4進行分組，以1×104個/mL濃度種植至12孔板中，待細胞貼壁后進行藥物處理12 d，每3 d更換一次培養液，藥物干預完成后用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛在37 ℃下固定30 min，然后用1%茜素紅染色30 min，觀察鈣化結節的形成情況。

1.2.6細胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達水平的檢測：將BMSCs按1.2.4進行分組與藥物干預12 d后，按照試劑盒說明書試劑盒提取細胞總RNA，進行逆轉錄得到cDNA并進行擴增，qPCR擴增過程為：95 ℃變性30 s，62 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，45個循環，以β-actin作為內參基因，以2-ΔΔCT反映細胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達水平。

1.2.7蛋白質印跡(Western blot)：收集各組細胞，使用RIPA裂解緩提取總蛋白并進行定量，依次進行10% SDS-PAGE凝膠電泳(上樣量為40 μg)、轉移到PVDF膜、置于5%脫脂奶粉溶液中室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗：TGF-β1(1∶1000)、Smad2(1∶1000)、p-Smad2(1∶1000)、Smad3(1∶1000)和p-Smad3(1∶1000)和β-actin(1∶1500)。漂洗干凈后在室溫中孵育二抗(1∶5000)2 h，使用ECL法進行顯影后置于凝膠成像系統中曝光拍照，計算目的蛋白表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 積雪草苷對BMSCs增殖、凋亡率的影響

與0 μmoL/L組相比，5、10、20 μmoL/L積雪草苷對BMSCs均無抑制與促凋亡作用(P>0.05)，30、40 μmoL/L積雪草苷均能降低BMSCs細胞增殖率，升高細胞凋亡率(P<0.01)，因此后續實驗以20 μmoL/L積雪草苷為最大無毒濃度。結果見表1，圖1。

表1 不同濃度積雪草苷對BMSCs增殖率的影響

圖1 不同濃度積雪草苷對BMSCs凋亡率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of asiaticoside on apoptosis rate of BMSCs注：A、B、C、D、E、F分別代表0、5、10、20、30、40 μmoL/L濃度的積雪草苷。

2.2 積雪草苷對BMSCs成骨分化的影響

20 μmoL/L積雪草苷對BMSCs進行誘導培養12 d后，茜素紅染色發現積雪草苷組礦化結節數目明顯多于空白對照組。茜素紅染色結果見圖2。

圖2 不同濃度積雪草苷對BMSCs成骨分化的影響(茜素紅染色)Fig.2 Effect of asiaticoside on osteogenic differentiation of BMSCs (Alizarin red staining)注：A、B分別代表0、20 μmoL/L積雪草苷處理(圖中紅點為礦化結節)

2.3 積雪草苷對BMSCs成骨分化基因表達的影響

與空白對照組相比，積雪草苷組細胞中ALP、OPN和OCN基因表達水平升高(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

2.4 積雪草苷對BMSCs中TGF-β/Smads通路的影響

與空白組相比，積雪草苷組細胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達水平升高(P均<0.01)，Smad2與Smad3蛋白表達水平沒有變化(P均>0.05)，詳見表3、圖3。

圖3 不同組別積雪草苷對BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表達水平的影響Fig.3 Effects of asiaticoside on protein expression levels of TGF-β1, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 in BMSCs

2.5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對BMSCs骨分化的影響

與空白對照組相比，積雪草苷組細胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達水平升高(P均<0.01)。與積雪草苷組相比，抑制組細胞中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達水平降低(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對BMSCs中TGF-β1、ALP、OPN和OCN基因表達的影響Table 4 Effects of asiaticoside on TGF-β1, ALP, OPN and OCN gene expression in BMSCs after inhibition of TGF-β/

茜素紅染色發現，肉眼觀察3組礦化結節數目，積雪草苷組最多，抑制苷組次之，空白對照組最少。染色結果見圖4。

圖4 積雪草苷對BMSCs成骨分化的影響(茜素紅染色)Fig.4 Effect of asiaticoside on BMSCs osteogenic differentiation (Alizarin red staining)注：A、B、C分別代表0、20 μmoL/L積雪草苷處理、50 nmoL/L SB-431542+20 μmoL/L積雪草苷處理

與空白對照組相比，積雪草苷組細胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3的蛋白表達水平升高(P均<0.01)，Smad2與Smad3蛋白表達水平沒有變化(P均>0.05)；與積雪草苷組相比，抑制組細胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義(P<0.05)，Smad2與Smad3蛋白表達水平無明顯變化(P>0.05)。詳見表5、圖5。

表5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3基因表達的影響

圖5 抑制TGF-β/Smads通路后積雪草苷對BMSCs中TGF-β1、Smad2、p-Smad2、Smad3和p-Smad3蛋白表達水平的影響Fig.5 Effects of asiaticoside on the protein expression levels of TGF-β1, Smad2, p-Smad2, Smad3, and p-Smad3 in BMSCs after inhibition of TGF-β/Smads pathway

3 討論

BMSCs是骨髓微環境中的細胞組分之一，是骨細胞、軟骨細胞和其他類型的細胞的祖細胞，這些細胞參與了骨骼組織、造血支持基質和脂肪組織的形成[11-12]，與調節造血、免疫、成骨等生理功能密切相關[13]。目前研究發現，BMSCs移植被認為是治療OP的一個有前途的策略，同種異體和自體BMSCs均有效[14-15]。BMSCs向脂肪細胞的偏分化可能導致成骨細胞的減少和OP發病增加。因此，各種可促進BMSCs成骨分化的調控因子可能是治療OP的潛在治療藥物[16-17]。本研究發現積雪草苷對BMSCs具有良好的誘導成骨分化能力，對TGF-β/Smads通路也有一定的調節作用，是一種治療OP的潛在藥物。

眾所周知，TGF-β1是調節多種生理功能的關鍵因子之一。例如，TGF β1可以通過重組細胞骨架使祖細胞進入成脂或成骨細胞譜系，從而提高間充質干細胞的成骨能力[18-19]。多種類型細胞及不同成熟階段的成骨細胞均能合成和分泌OPN，是成骨細胞分化成熟的標志[20]。ALP與OCN都是骨分化成熟的標志，作為成骨細胞的標記基因，ALP在早期成骨中發揮重要作用[21]，ALP在未成熟的骨前體細胞中不表達，但隨著成骨分化，ALP的表達逐漸增加[22]。ALP產生磷酸鈣沉積在成熟成骨細胞中，促進成骨礦化，而OCN是參與礦化調控的最豐富的蛋白[23]。在本實驗中，BMSCs經積雪草苷處理12 d后，TGF-β1、OPN、ALP與OCN的基因表達量升高，細胞成骨分化后礦化結節形成數量增加，說明BMSCs細胞出現成骨分化且程度較高，證明積雪草苷對BMSCs細胞骨分化具有明顯誘導作用，其中涉及的機制需要進一步實驗進行驗證。

Smads蛋白是TGF-β超家族成員信號轉導的關鍵，Smad2/3作為TGF-β的下游信號蛋白分子，可以通過與轉錄調控因子相互作用來調控靶基因的活性[24-25]。既往研究表明，OP患者外周血中TGF-β1表達降低，說明TGF-β/Smads通路對OP進程有密切聯系[26]，然而，積雪草苷誘導BMSCs細胞成骨分化的效果與TGF-β/Smads通路之間的聯系還不明確。本實驗首先使用SB-431542抑制BMSCs細胞中的TGF-β/Smads通路，再使用積雪草苷進行干預，發現積雪草苷在TGF-β/Smads通路處于抑制狀態的情況下仍然能發揮誘導骨分化的效果，細胞中TGF-β1、p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平升高，Smad2與Smad3蛋白表達水平無明顯變化，說明積雪草苷能增加TGF-β1表達，促進Smad2、Smad3磷酸化，對抗抑制劑產生的TGF-β/Smads通路抑制效果，從而誘導TGF-β1、OPN、ALP與OCN基因表達，促進成骨分化形成鈣化結節。

綜上所述，本實驗證明了積雪草苷具有誘導骨髓間充質干細胞骨分化的潛力，可能涉及的機制為激活細胞中TGF-β/Smads通路，上調OPN、ALP與OCN基因表達量，幫助骨髓間充質干細胞完成成骨分化。