人乳頭瘤病毒基因亞型在尖銳濕疣患者及疑似患者中流行情況研究

陳 晨，朱琴芳，徐紅星

（南京醫科大學附屬蘇州市立醫院醫學檢驗科，江蘇 蘇州 215002）

人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）是一種嗜人體組織細胞的DNA病毒，可廣泛感染人類皮膚、生殖道組織，引發增生性疾病，如尖銳濕疣（Condyloma acuminatum，CA），尖銳濕疣又稱生殖器疣或病毒疣，近年來其發病率有上升趨勢［1］。目前可分離200多種HPV基因亞型，與人類常見疾病相關的有30多種亞型，不同型別的HPV致病能力差異較大，依據HPV引起的增生性病變是否致癌，將其分為低危型和高危型，包括低危亞型6、11、42、43、44等，高 危 亞 型16、18、31、33、39、45、51、52、56、58型等［2］。為了解本地區尖銳濕疣感染年齡、性別、基因亞型等分布情況，筆者應用流式熒光雜交技術，就383例本院皮膚科就診的尖銳濕疣患者及疑似患者進行HPV-DNA基因亞型檢測，包括低危亞型HPV6、11、40、42、43、44、55、61、81、83十種型別，高危亞型HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82十七種型別，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料 尖銳濕疣患者及疑似患者383例來自本院皮膚科2018年8月1日至2020年1月30日的就診患者，其中男性217例，女性166例，年齡（16～70）歲，平均年齡（33.1±10.7）歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 暴露疣體的疑似尖銳濕疣患者，行常規消毒，用無菌鑷子摘取疣體組織，存放于專用保存液送檢。其余患者，女性用無菌棉拭子擦去宮頸口的分泌物，用宮頸刷旋轉4至5圈收集脫落細胞，或用無菌棉拭子于相應皮損部位反復摩擦后取出放入保存液送檢；男性患者，也用無菌棉拭子于相應皮損部位反復摩擦，置保存液送檢。

1.2.2 主要試劑和儀器

1.2.2.1 試劑 上海浩源生物科技有限公司生產的核酸提取試劑，上海透景生命科技股份有限公司生產的人乳頭瘤病毒核酸分型檢測試劑（流式熒光雜交法）。

1.2.2.2 儀器 PerkinElmer Pre-NAT全自動核酸檢測反應體系構建系統，ABI-Veriti基因擴增儀，多功能流式點陣儀Luminex200。

1.2.3 檢測方法

1.2.3.1 核酸提取 采用Pre-NAT全自動核酸檢測反應體系構建系統應用磁珠法進行樣本核酸提取。高濃度胍鹽將細胞或病毒蛋白外殼裂解，釋放出核酸，游離的核酸吸附到磁珠顆粒表面，洗滌去除溶液中的雜質，最后將核酸從磁珠上洗脫下來，作為下游實驗用模板。

1.2.3.2 流式熒光雜交方法 原理：采用通用引物多重PCR擴增，流式熒光雜交分型檢測的方法，同時檢測27種HPV DNA。試劑盒共設置了2類探針和28顆分類微球，其中，與HPV DNA雜交的探針包被在27個分類微球上，對應型別特異性探針的信號為陽性將被判定為該型別HPV陽性，質控微球是與人β球蛋白（β-globin）基因雜交的探針，它的結果提示取樣、提取模板、PCR擴增和雜交整個過程是否符合要求。首先PCR擴增待檢測樣本DNA，得到的PCR產物與微球上交聯的探針根據堿基互補配對原理雜交，微球上相應探針捕獲到標有生物素（Biotin）的PCR產物，加入標記了鏈霉親和素（SA）的藻紅蛋白（PE）后，形成微球-探針-PCR產物-Biotin-SA-PE復合物，最后在多功能流式點陣儀上檢測熒光信號。擴增與雜交參數：擴增體系為：10μl反應液，5μl引物，0.8μl聚合酶，5μl模板；擴增條件為：95℃ 5min、95℃ 30s、58℃ 30s、68℃ 30s擴 增5個 循 環，95℃ 30s、55℃ 30s、68℃30s擴增30個循環；雜交條件為：3μl擴增產物加22μl微球混勻，95℃ 5min、48℃ 30min，加75μlLSA-PE、48℃ 15min。

結果判斷：如果PCR產物和探針完全配對，則在流式點陣儀上即可檢測到分類微球的熒光信號，信號大于等于150，結果判斷為陽性；如果PCR產物和探針不配對，則分類微球的熒光信號為背景信號，檢測結果為陰性。

1.3 統計學處理 應用SPSS16.0軟件進行統計，計數資料采用χ2檢驗，P ＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 尖銳濕疣患者及疑似患者年齡和性別構成 （21～30）歲年齡段就診患者人數最多，占總人數的44.9%，其次為（31～40）歲年齡段，占30.8%，最少為＞60歲年齡段，占3.1%。就診患者男性多于女性，分別占56.7%、43.3 %，男性和女性就診人數均為（21～30）歲年齡段最多，分別占男女人數的45.2%、44.6%。＞60歲年齡段就診患者以男性為主，占該年齡段男女人數83.3%，其次為（41～50）歲，占78.4%，≤20歲年齡段就診患者以女性為主，占70%。具體結果見表1。

表1 383例就診患者各年齡段性別構成

2.2 HPV總體感染及各年齡段男女患者感染率 383例就診患者HPV陽性277例，陽性率為72.3%，其中男性感染158例，感染率為72.8%，女性119例，感染率71.7%，男女感染率差異不顯著（χ2=0.059，P=0.807）。感染人群主要為（21～30）歲和（31～40）歲年齡段人群，感染率分別為68.6%和71.2%，（41～50）年齡段男性感染率明顯高于女性，除該年齡段外其余年齡段感染性別差異不明顯（χ2=6.286，P=0.179），男性最高感染率年齡段為＞60歲，該年齡段男性100%陽性，女性感染率最高年齡段為（51～60）歲和＞60歲，均為100%陽性。具體結果見表2。

表2 277例HPV感染患者不同性別各年齡段感染率

2.3 就診患者感染類型 多重亞型高于單一亞型感染率，分別為37.6%和34.7%，不同年齡段單一感染與多重感染存在差異（χ2=16.679，P=0.005），二重以上亞型高達18.0%；低危亞型和高低危亞型混合感染為感染主要類型，兩者感染率（29.5%和26.6%）高于高危亞型（16.2%），低危亞型及高危亞型均以單一亞型感染為主（23.5%與11.2%）。具體結果見表3和4 。

表3 277例HPV感染患者亞型數量與年齡段分布

2.4 檢測結果亞型 低危亞型HPV6和11為主要型別。低危型感染陽性率排前五的是HPV6、11、81、43、55，依次為28.2%、17.0%、8.4%、5.5%、4.7%；高危型感染陽性率排前的是HPV16/52、58、51/68，依次為7.8%、7.0%、5.7%。HPV6多重略多于單一感染例數（58 vs 50），HPV11多重感染則明顯多于單一感染例數（43 vs 22），其余各亞型也均為多重多于單一感染。從年齡結構分析各亞型，總體上分布在（21～30）歲，其次是（31-40）歲年齡段。具體結果見表5。

表5 277例HPV感染患者檢測結果亞型

3 討論

尖銳濕疣是臨床常見的生殖器疾病，主要傳播途徑是性傳播，常以亞臨床感染形式存在，隱匿性、傳染性強、復發率高，是由人乳頭瘤病毒HPV引起的增生性疾病［3-4］。HPV是直徑為50-55nm DNA病毒，具有高度的宿主專一性，由雙鏈DNA構成，包括7900個核苷酸，所有HPV病毒的基因組結構相似，嚴格條件下進行雜交可確定病毒亞型。研究表明，HPV基因型的分布和流行存在明顯的種族和地區差異，某種型別在特定區域占主導地位［5-7］。因此，了解本地區尖銳濕疣患者及疑似患者中HPV感染的年齡、型別等對流行病學調查具有重要意義。

表4 277例HPV感染患者高危與低危型感染情況

門診就診尖銳濕疣患者及疑似患者的年齡和性別分布情況分析表明，就診患者在（21～30）歲年齡段為峰值（44.9%），隨年齡增長而呈下降趨勢（除外20歲及以下年齡段患者），與阮建波等結果一致［8］。就診患者性別為男性多于女性，就各年齡段男女比例分析，基本為隨年齡增加男性患者比例增加，60歲年齡段達83.3%；女性患者隨年齡增加而減少，20歲及以下患者有70%為女性，應引起足夠重視。有關就診患者男女比例問題，未見有文獻報道。

本次研究中，對總體感染率及各年齡段及男女各自的感染率進行了分析，結果表明，總體感染率男性與女性（72.8% vs 71.7%）經統計學分析無顯著性差異。最高感染年齡段為（21～30）歲、（31～40）歲，合計感染率為72.9%，即以青年人為主要感染人群，與王穩等報道（21～30）歲檢出數最多一致［9］。50歲以上的高年齡患者盡管就診患者數少（36例），但共有35例陽性患者，該年齡段的感染率高達97.2%，即高年齡就診患者一旦接觸病毒，就有極高感染風險，可能與其免疫功能差有一定相關［10-11］。對該類人群，應做好宣傳，避免直接或間接接觸。

分析本組患者的單一和多重感染結果表明，277例感染者中，多重感染比例高于單一感染比例（52.0% vs 48.0%）。馬貴濤［12］等報道，女性尖銳濕疣患者HPV單一感染60.51%多于多重感染39.49%，可能與單純分析女性人群有關。同時，多重感染中二重感染比例與三重及以上感染比例基本各占一半，最多高達七重感染，分析其原因，可能尖銳濕疣患者因復發而導致不同亞型的感染。文獻報道，尖銳濕疣患者存在細胞免疫功能異常，導致HPV發生免疫逃逸，從而引起反復感染［13-15］。從低危和高危亞型感染分析，本研究結果中，尖銳濕疣患者的感染以單純低危和高低危混合感染為主，分別占HPV感染患者感染類型的40.8%和36.8%，剩余22.4%為單純高危亞型感染，說明HPV低危亞型是尖銳濕疣患者的主要病原體［16］，但相當一部份人群單純感染高危亞型，故針對尖銳濕疣患者，應進行HPV高低危分型檢測，而不能僅檢測HPV低危亞型。

文獻報道，女性宮頸HPV亞型感染存在地域差異［17-20］。本文感染亞型結果分析顯示，HPV6、HPV11是尖銳濕疣感染的主要型別，其次是HPV81、HPV16、HPV52。大連王穩等報道感染亞型前五依次為HPV11、HPV6、HPV16、HPV52、HPV53/58，廣東馬貴濤［12］等報道主要感染型別依次為HPV11、HPV6、HPV43、HPV16、HPV52/58，與本文結果有區別，故尖銳濕疣患者HPV感染存在地域差異，包括主要感染型別不同、陽性率不同及感染年齡段差異。