紅肉冰糖橙的品質與遺傳鑒定

周 嘉， 李 娜， 戴素明， 鄧子牛， 李大志*

(1.湖南農業大學 園藝學院， 湖南 長沙 410128； 2.貴州省果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】湖南柑橘栽培歷史悠久，目前種植面積居全國第二，是國內重要的甜橙產區之一[1]。冰糖橙(CitrussinesisOsback)又名冰糖柑，是20世紀70年代選育的優良低酸甜橙品種[2]，具有低酸、脆嫩化渣等優點，與國內外其他低酸類甜橙品種有明顯區別，是湖南重點推廣的優良甜橙品種[3]。冰糖橙經過多年發展，深受廣大消費者喜愛，已成為湖南特色主栽甜橙品種，在湖南洪江、麻陽、永興以及云南新平有大面積推廣種植[4]。開展紅肉冰糖橙育種工作可進一步豐富冰糖橙產區品種資源，為冰糖橙產業發展提供更多的品種選擇，對其產業持續健康發展具有重要意義。【前人研究進展】近年來，全球柑橘育種成果豐碩，通過芽變選種、資源發掘和雜交選育等方式已培育出100余個柑橘品種，特別是鮮食柑橘品種[5-6]。柑橘品種選育多依賴于芽變選種，尤其是性器官敗育的臍橙和溫州蜜柑品種，紅肉臍橙是從華盛頓臍橙中發現的果肉紅色芽變[7]，橘湘早[8]、由良[9]和宮川等均是從溫州蜜柑中選育出來的不同熟期芽變品種。資源調查發掘野生和地方良種也是柑橘育種的有效途徑，資陽香橙[10]即是從地方資源中選育出來的優良柑橘砧木，馬家柚、琯溪蜜柚和安江香柚等均是從地方良種中發掘選育而成。受珠心胚干擾，柑橘雜交品種數量相對較少，愛媛28、沃柑、不知火和W莫科特等是國外選育的優良雜柑品種，中國選育的金秋砂糖橘、大雅柑市場反映良好。其中，湖南通過芽變選種等手段選育出錦玉[11]、錦紅[12]、錦秀[13]和黔陽冰糖臍橙[14]等冰糖橙品種，與普通冰糖橙相比果實品質均有一定提升，對湖南柑橘品種結構調整具有重要作用，現已得到大力推廣，獲得較好的經濟效益[15]。【研究切入點】紅肉柑橘因其色澤鮮艷而具有特殊的市場潛力，但目前還鮮見紅肉類型冰糖橙品質分析與遺傳鑒定的研究報道。從郴州某冰糖橙果園中篩選出冰糖橙紅肉芽變，經初步觀察發現，該變異株系紅肉性狀穩定，并對其果實品質進行分析與汁胞紅色色素檢測以及遺傳變異分子標記分析。【擬解決的關鍵問題】探明紅肉冰糖橙的品質及遺傳變異狀況，以期為紅肉冰糖橙芽變品種的選育及其開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 果實 果實均為紅肉冰糖橙、普通冰糖橙和紅肉臍橙成熟鮮果，均于2018年11月24日采自湖南郴州，采集樣品時選樹齡、樹勢相對一致的成年結果樹，每株樹隨機采摘果實25個，采樣樹的砧木均為枳〔Poncirustrifoliata(L.) Raf〕；果實用于品質及汁胞紅色色素分析。

1.1.2 樣品葉片 試驗樣品紅肉冰糖橙為芽變甜橙，對照樣品普通冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙均為甜橙；樣品葉片用于遺傳鑒定，由國家柑橘改良中心長沙分中心實驗室完成。

1.1.3 儀器 U-3900紫外可見分光光度計，日立(中國)有限公司；Infinite 200 PRO NanoQuant酶標儀，瑞士帝肯(上海)貿易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 指標測定

1) 果實品質。果實橫、縱徑及皮厚采用游標卡尺測量；果實重量采用電子天平稱量；果汁可溶性固形物含量采用手持測糖儀測定；可滴定酸含量用酸堿滴定法測定；維生素C含量參照文獻[16]的方法采用抗壞血酸標定法測定。

可食率=(果實質量-果皮質量-種子質量)/果實質量×100%

出汁率=(果汁質量/果實質量)×100%

2) 汁胞紅色色素含量。β-胡蘿卜素和番茄紅素含量，參照文獻[17]的方法采用HPLC法測定。將柑橘汁胞凍干研磨成粉末，稱取0.2 g樣品于15 mL離心管中，加入6 mL丙酮；用錫箔紙將離心管包住，封緊瓶蓋，冰浴超聲2 h，4℃、1 000 r/min離心10 min；取5 mL上清常溫濃縮，再加入500 μL丙酮復溶，4℃、1 200 r/min離心10 min；取20 μL上清HPLC液相分析。類胡蘿卜素含量，參照文獻[18]的方法采用分光光度計法測定。將甜橙汁胞凍干，稱取0.03 g樣品，加入3 mL 80%丙酮研磨成勻漿，將研磨液轉移到玻璃試管中；用2 mL 80%丙酮沖洗研缽，并將沖洗液轉移到玻璃試管中，重復沖洗3次，依次將沖洗液轉移到玻璃試管；加塞并用封口膜封緊，常溫下放暗處浸提48 h，至樣品褪去顏色發白為止；用80%丙酮定容至25 mL，搖勻，此液即為類胡蘿卜素提取液。分別測定類胡蘿卜素提取液與80%丙酮在波長663 nm、645 nm和470 nm下的吸光度，計算類胡蘿卜素含量。

1.2.2 遺傳變異分子標記分析 采用改良CTAB法提取各甜橙的葉片DNA，并用酶標儀檢測其濃度和純度。從實驗室柑橘分子數據庫中篩選遺傳變異分子標記鑒定位點，利用Primer 5設計引物(正向引物序列為GCCACAGAGCAGACAGGAA，反向引物序列為CACGGTGTCGAGGAGACTTT)，對紅肉冰糖橙進行PCR擴增，PCR產物在2%瓊脂糖凝膠上120 V電泳40 min，結束后置于凝膠成像系統觀察并拍照。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 17.0 對數據進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 紅肉冰糖橙的品質

2.1.1 果實品質 從表1可知，紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙橫徑、縱徑、單果重、皮厚和可食率的差異。橫徑和縱徑分別為65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；單果重為143.86～252.00 g, 依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；皮厚為3.28～3.96 mm，依次為普通冰糖橙>紅肉臍橙>紅肉冰糖橙；可食率為62.81%～65.90%，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；出汁率為41.95%～53.97%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；可溶性固形物為11.33%～12.53%，依次為普通冰糖橙>紅肉冰糖橙>紅肉臍橙；可滴定酸為0.20%～0.78%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；固酸比為14.53～58.30，依次為紅肉冰糖橙>普通冰糖橙>紅肉臍橙；維生素C為58.36～63.39 mg/100mL，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙。從圖1看出，紅肉冰糖橙與普通冰糖橙相比，果肉為紅色，果實相對較小，出汁率較低；與紅肉臍橙相比，紅肉冰糖橙在果梗及果皮白皮層處也有紅色著色。

表1 不同甜橙品種的果實品質

圖1 不同甜橙品種的果實切面示意

2.1.2 汁胞紅色色素含量 從表2看出，紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙β-胡蘿卜素、番茄紅素和類胡蘿卜素含量的變化。β-胡蘿卜素為3.34～70.98 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著；番茄紅素為0.74～3.19 μg/g，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著；類胡蘿卜素為69.72～212.87 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙，各品種間差異顯著。

表2 不同甜橙品種汁胞紅色色素的含量

2.2 紅肉冰糖橙的遺傳鑒定

從圖2看出，引物合成后經PCR擴增結果顯示，紅肉冰糖橙在100～250 bp出現特異性條帶，說明其與普通冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙等對照在DNA水平存在差異，具有成為新品種的遺傳基礎。

注：2K為Trans 2K DNA Maker；1為紅肉冰糖橙，2～5分別為冰糖橙、橘湘瓏冰糖橙、錦玉冰糖橙和紅肉臍橙(對照)。

3 討論

目前，國內大規模種植的紅肉類型甜橙主要是紅肉臍橙和血橙，2個品種果實酸度較高，果實成熟期均在12月以后，選育紅肉冰糖橙可讓紅肉類型甜橙提早上市，搶占市場[5-6]。湖南通過芽變選種等手段選育出錦玉和錦紅等[11-14]冰糖橙品種，與普通冰糖橙相比果實品質有一定提升，對湖南柑橘品種結構調整具有重要作用[15]。紅肉冰糖橙果肉顏色與紅肉臍橙接近，其主要著色色素也是番茄紅素，初步推測紅肉冰糖橙果肉著色機理可能與紅肉臍橙相似[19]。研究結果表明，在紅肉冰糖橙、紅肉臍橙和普通冰糖橙中，果實橫徑和縱徑分別為65.66～79.18 mm和63.58～77.84 mm，均為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；皮厚為3.28～3.96 mm，依次為普通冰糖橙>紅肉臍橙>紅肉冰糖橙；可食率為62.81%～65.90%，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；可溶性固形物為11.33%～12.53%，依次為普通冰糖橙>紅肉冰糖橙>紅肉臍橙；維生素C為58.36～63.39 mg/100mL，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙；可滴定酸為0.20%～0.78%，依次為紅肉臍橙>普通冰糖橙>紅肉冰糖橙。β-胡蘿卜素為3.34～70.98 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙；番茄紅素為0.74～3.19 μg/g，依次為紅肉冰糖橙>紅肉臍橙>普通冰糖橙；類胡蘿卜素為69.72～212.87 μg/g，依次為紅肉臍橙>紅肉冰糖橙>普通冰糖橙；各品種間3種色素含量均差異顯著。引物合成后經PCR擴增，紅肉冰糖橙在100～250 bp出現特異性條帶，與普通冰糖橙在DNA水平存在差異。普通冰糖橙成熟期為11月下旬或12月上旬，紅肉冰糖橙成熟期為11月上中旬，略有提前，可提早采收期，錯開普通冰糖橙上市高峰期，有利于提高其經濟效益。

4 結論

紅肉冰糖橙果實為紅肉、低酸、早熟、無籽或少籽，其品質較普通冰糖橙明顯提升，引物合成后經PCR擴增，在100～250 bp出現特異性條帶，與普通冰糖橙在DNA水平存在差異，具有成為新品種的遺傳基礎。