基于NR3C1/p53/SLC7A11通路探討龍牙楤木總皂苷及其成分楤木皂苷A對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的影響

梁芳，魯衛(wèi)星，周天琪，王胤博

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指缺血心肌在恢復(fù)血流供應(yīng)后出現(xiàn)更為嚴(yán)重的損傷，也是血運重建術(shù)后出現(xiàn)致死性心律失常、梗死面積擴(kuò)大甚至猝死等主要原因之一，因此減輕血管再通后MIRI成為臨床亟待解決的問題。有研究顯示，鐵死亡參與了MIRI過程，而p53在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI中，糖皮質(zhì)激素受體NR3C1表達(dá)下調(diào)，而NR3C1的激活可抑制p53轉(zhuǎn)錄活性。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，龍牙楤木總皂苷（As）能減輕缺氧/復(fù)氧（H/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，但未涉及鐵死亡相關(guān)機制研究。筆者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，NR3C1是As主要成分楤木皂苷A（As A）和MIRI的共同靶基因。基于此，本實驗通過構(gòu)建H/R誘導(dǎo)的AC16心肌細(xì)胞損傷模型，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)或沉默NR3C1，觀察As和As A對NR3C1/p53/SLC7A11通路的影響，探討其調(diào)控H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與藥物

AC16人心肌細(xì)胞購自美國模式培養(yǎng)物集存庫；As由吉林省中醫(yī)藥研究院提供，以DMSO溶解，配制成濃度為1 g/L貯備液；As A購自上海源葉生物公司，以DMSO溶解，配制成濃度為50 mg/mL貯備液。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清（美國Gibco公司，批號1861242），DMEM無糖培養(yǎng)基（美國Gibco，貨號11966025），DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，貨號SH30022.01），DHE熒光探針（南京凱基生物公司，貨號KGAF019），谷胱甘肽（GSH）ELISA試劑盒（武漢伊萊瑞特公司，貨號E-EL-0026c），丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒（武漢伊萊瑞特公司，貨號E-EL-0060c），NR3C1抗體（英國Abcam公司，貨號ab261862），p53、SLC7A11抗體（美國CST公司，貨號分別為2524S、12691S），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司，貨號11668019）。超凈臺（蘇州凈化設(shè)備公司，型號SW-CJ-1FD），全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海天能，型號4100），RT-PCR儀（美國Bio-Rad，型號iQ5），電泳儀（上海天能公司，型號EPS300），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)公司，型號BPX-82），臺式高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司，型號HC-3618R）。

1.3 造模

AC16細(xì)胞用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基），置于37 ℃、常氧培養(yǎng)箱中（5%CO、21%O、74%N）培養(yǎng)。H/R損傷模型制備時，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成缺氧培養(yǎng)液（氮氣預(yù)飽和的無血清、無糖DMEM培養(yǎng)基），并移至缺氧培養(yǎng)箱（94%N、5%CO、1%O）培養(yǎng)相應(yīng)時間，再換成完全培養(yǎng)基并移至常氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)相應(yīng)時間。將細(xì)胞分別缺氧12 h/復(fù)氧12 h、缺氧24 h/復(fù)氧12 h、缺氧48 h/復(fù)氧12 h處理，同時設(shè)置對照組（缺氧0 h/復(fù)氧0 h），RT-PCR和Western blot分別檢測NR3C1、p53 mRNA和蛋白表達(dá)，確定造模條件。

1.4 分組及給藥

取對數(shù)生長期AC16細(xì)胞，按2×10個/孔密度接種于6孔板。將細(xì)胞分為8組。①正常組：正常培養(yǎng)，不做任何處理；②H/R組：按優(yōu)選的造模條件造模，即缺氧24 h/復(fù)氧12 h；③As組（As＋H/R）：0.1 μg/mL As預(yù)處理6 h后進(jìn)行造模處理；④As A組（As A＋H/R）：50 μg/mL As A預(yù)處理6 h后進(jìn)行造模處理；⑤過表達(dá)空載體組（過表達(dá)空載體＋H/R）：轉(zhuǎn)染NR3C1空載體48 h后進(jìn)行造模處理；⑥NR3C1過表達(dá)組（NR3C1＋H/R）：轉(zhuǎn)染NR3C1質(zhì)粒48 h后進(jìn)行造模處理；⑦沉默對照組（si-NC＋As＋H/R）：轉(zhuǎn)染si-NC質(zhì)粒48 h后0.1 μg/mL As預(yù)處理6 h，進(jìn)行造模處理；⑧NR3C1沉默組（si-NR3C1＋As＋H/R）：轉(zhuǎn)染si-NR3C1質(zhì)粒48 h后0.1 μg/mL As預(yù)處理6 h，進(jìn)行造模處理。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

AC16細(xì)胞以2×10個/孔密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長融合至70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和質(zhì)粒恢復(fù)至室溫，取5 μL Lipofectamine 2000用250 μL DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋，室溫靜置5 min；另取250 μL DMEM高糖培養(yǎng)基，加入2.5 μg質(zhì)粒（NR3C1質(zhì)粒、NR3C1空載體、si-NR3C1質(zhì)粒或si-NC質(zhì)粒），輕輕吹打均勻，將Lipofectamine 2000稀釋液加入質(zhì)粒溶液中混勻，室溫靜置20 min；提前5 min從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，DMEM高糖培養(yǎng)基清洗細(xì)胞1次，每孔加入1.5 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，將質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合液逐滴加入各孔中，每孔0.5 mL，輕輕晃動混勻，繼續(xù)放入37 ℃、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，棄去培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)處理。

1.6 RT-PCR檢測

收集各組細(xì)胞，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)說明書配制反應(yīng)體系，進(jìn)行RT-PCR，采用2法計算NR3C1和p53 mRNA相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.7 活性氧水平檢測

以DMSO溶解DHE，制成5 mmol/L貯備液，用DMEM高糖培養(yǎng)基將貯備液稀釋成終濃度為5 μmol/L的工作液。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入1 mL工作液，37 ℃避光孵育20～30 min，DMEM高糖培養(yǎng)基清洗細(xì)胞，流式細(xì)胞儀觀察，計算ROS含量。

1.8 丙二醛和谷胱甘肽含量檢測

細(xì)胞經(jīng)分組處理后，棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞1次，收集細(xì)胞，1 000×離心5 min，棄去上清液，沉淀加入200 μL PBS重懸，反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，4 ℃、1 500×離心10 min，取上清液，按ELISA試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀波長450 nm處檢測各孔吸光度，計算MDA和GSH含量。

1.9 Western blot檢測

收集各組細(xì)胞，加入適量裂解液冰上裂解45 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100 ℃處理5 min。電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入NR3C1、p53、SLC7A11一抗（均按1∶500稀釋），4 ℃孵育過夜，TBST洗滌4次，加入相應(yīng)二抗（1∶1 000），37 ℃孵育2 h，TBST洗滌4次，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.10 免疫熒光檢測

細(xì)胞經(jīng)分組處理后，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗5 min×3次，0.3%Triton X-100破膜5 min，10%羊血清室溫封閉1 h，加入NR3C1、p53一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS洗5 min×3次，加入熒光二抗（1∶300）避光孵育2 h，PBS洗5 min×2次，加入DAPI（1∶1 000）室溫避光孵育7～10 min，PBS洗5 min×3次，熒光顯微鏡下觀察并拍照，計算NR3C1和p53熒光強度。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±表示，數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布，組間比較用方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同缺氧/復(fù)氧時間對AC16細(xì)胞NR3C1和p53 mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與缺氧0 h/復(fù)氧0 h比較，缺氧12 h/復(fù)氧12 h、缺氧24 h/復(fù)氧12 h、缺氧48 h/復(fù)氧12 h處理后，AC16細(xì)胞NR3C1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，p53 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，且呈時間依賴性（＜0.05）。當(dāng)缺氧24 h/復(fù)氧12 h時，p53 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)、NR3C1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，因此選擇缺氧24 h/復(fù)氧12 h進(jìn)行后續(xù)實驗。見表2、圖1。

表2 不同H/R造模條件對AC16細(xì)胞NR3C1和p53 mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

圖1 不同H/R造模條件下AC16細(xì)胞NR3C1、p53蛋白免疫印跡

2.2 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對AC16細(xì)胞活性氧水平的影響

與正常組比較，H/R組AC16細(xì)胞ROS水平明顯升高（＜0.05）；與H/R組比較，As組、As A組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞ROS水平明顯降低（＜0.05）；與過表達(dá)空載體組比較，As組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞ROS水平明顯降低（＜0.05）；與AS組及沉默對照組比較，NR3C1沉默組AC16細(xì)胞ROS水平明顯升高（＜0.05）。見表3。

表3 各組AC16細(xì)胞ROS水平比較（±s，%）

2.3 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對AC16細(xì)胞丙二醛、谷胱甘肽含量的影響

與正常組比較，H/R組AC16細(xì)胞MDA含量明顯升高，GSH含量明顯降低（＜0.05）；與H/R組比較，As組、As A組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高（＜0.05）；與過表達(dá)空載體組比較，As組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞MDA含量明顯降低，GSH含量明顯升高（＜0.05）；與AS組及沉默對照組比較，NR3C1沉默組AC16細(xì)胞MDA含量明顯升高，GSH含量明顯降低（＜0.05）。見表4。

表4 各組AC16細(xì)胞MDA、GSH含量比較（±s）

2.4 龍牙楤木總皂苷及楤木皂苷A對AC16細(xì)胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，H/R組AC16細(xì)胞NR3C1和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低，p53蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）；與H/R組比較，As組、As A組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞NR3C1和SLC7A11蛋白表達(dá)明顯升高，p53蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與過表達(dá)空載體組比較，As組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞NR3C1、SLC7A11蛋白表達(dá)明顯升高，p53蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.05）；與As組及沉默對照組比較，NR3C1沉默組AC16細(xì)胞NR3C1、SLC7A11蛋白表達(dá)明顯降低，p53蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）。見圖2、表5。

表5 各組AC16細(xì)胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白表達(dá)比較（±s）

圖2 各組AC16細(xì)胞NR3C1、p53和SLC7A11蛋白免疫印跡

免疫熒光結(jié)果顯示，與正常組比較，H/R組AC16細(xì)胞NR3C1熒光強度降低，p53熒光強度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與H/R組比較，As組、As A組及NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞NR3C1熒光強度升高，p53熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與過表達(dá)空載體組比較，As組和NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞NR3C1熒光強度升高，p53熒光強度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；與As組及沉默對照組比較，NR3C1沉默組AC16細(xì)胞NR3C1熒光強度降低，p53熒光強度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。見圖3、表6。

圖3 各組AC16細(xì)胞NR3C1和p53陽性表達(dá)（免疫熒光染色，×200）

表6 各組AC16細(xì)胞NR3C1和p53熒光強度比較（±s）

3 討論

根據(jù)臨床表現(xiàn)，MIRI屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”范疇。病機多為本虛標(biāo)實，以氣虛血瘀為多見，其所致瘀血、痰濁等病理產(chǎn)物阻滯心脈，故治以益氣活血、化痰通絡(luò)為主。龍牙楤木為五加科楤木屬植物，主產(chǎn)于我國黑龍江、吉林、遼寧等地，其味辛、微苦、甘，性平，具有益氣活血、安神、止痛、利水、祛風(fēng)濕等功效，龍牙楤木總皂苷是其主要活性成分。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，龍牙楤木總皂苷可通過減輕氧化應(yīng)激、降低炎癥反應(yīng)、減少鈣超載、調(diào)節(jié)線粒體ATP敏感性鉀通道等途徑發(fā)揮對MIRI大鼠心臟的保護(hù)作用。

鐵死亡是一種新的細(xì)胞死亡方式，其主要特征是Fe水平升高、ROS堆積、GSH合成下降、脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物如MDA等含量增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜破損甚至細(xì)胞死亡。SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運體的組成部分，參與GSH合成，抑制SLC7A11表達(dá)可降低GSH活性。有研究顯示，p53可通過抑制SLC7A11表達(dá)促進(jìn)鐵死亡。NR3C1可影響生長、代謝、炎癥與應(yīng)激反應(yīng)等過程，以及心血管系統(tǒng)中的其他生物學(xué)過程，并參與調(diào)節(jié)p53活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在不同H/R時間造模條件下，AC16細(xì)胞NR3C1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，p53 mRNA和蛋白表達(dá)升高，且呈時間依賴性。經(jīng)As、As A處理后，NR3C1蛋白表達(dá)及GSH水平明顯升高，p53蛋白表達(dá)及ROS、MDA水平明顯降低。NR3C1過表達(dá)組AC16細(xì)胞p53蛋白表達(dá)及ROS、MDA水平較H/R組和過表達(dá)空載體組明顯降低，SLC7A11蛋白表達(dá)和GSH水平明顯升高，提示NR3C1可能通過p53/SLC7A11途徑抑制H/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡，降低氧化應(yīng)激水平。同時，NR3C1沉默組AC16細(xì)胞p53蛋白表及ROS、MDA水平達(dá)較As組及沉默對照組明顯升高，SLC7A11蛋白表達(dá)和GSH水平明顯降低，進(jìn)一步說明As通過NR3C1/p53/SLC7A11通路抑制心肌細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，As及As A可抑制H/R誘導(dǎo)的AC16心肌細(xì)胞鐵死亡，保護(hù)心肌細(xì)胞，其機制可能與上調(diào)NR3C1和SLC7A11蛋白表達(dá)、下調(diào)p53蛋白表達(dá)有關(guān)。