miR-1271-5p靶向FSCN1對肺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的影響

龍健 鄒靖 潘險峰 (荊州市中心醫院腫瘤科，湖北 荊州 434020)

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一〔1〕。非小細胞肺癌約占肺癌總數的85%，盡管手術治療、輔助化療在一定程度上改善了肺癌治療現狀，但由于發病隱匿，大多數患者被診斷為肺癌晚期且伴有遠端轉移，總體5年存活率≤18%〔2〕。因此，尋找新的靶點抑制肺癌細胞的侵襲轉移是肺癌治療的關鍵。研究顯示微小RNA(miRNA)在肺癌侵襲轉移中發揮至關重要的作用〔3〕。研究顯示miR-1271-5p在多發性骨髓瘤、腎細胞癌等惡性腫瘤中發揮抑癌基因，上調miR-1271-5p表達可抑制腫瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡〔4,5〕。然而目前未有miR-1271-5p在肺癌中作用的相關研究。肌動蛋白束蛋白(FSCN)1是一保守的細胞骨架蛋白，其可促進活細胞表面線狀突起的形成及細胞內F肌動蛋白組織排列成微絲束，增加細胞的運動能力〔6〕。FSCN1在肺癌組織中明顯上調，其可能通過參與上皮間質轉化過程促進肺癌轉移〔7〕。生物信息學分析顯示FSCN1是miR-1271-5p的潛在靶基因，但miR-1271-5p能否靶向FSCN1參與對肺癌細胞增殖、侵襲、遷移能力的調控尚未可知。本研究旨在揭示miR-1271-5p調控肺癌細胞增殖、侵襲、遷移的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2015年1月至2017年1月荊州市中心醫院進行肺癌切除的新鮮肺癌組織和與其對應的癌旁組織20例，術后經病理檢查確診。男14例，女6例，年齡48～76歲，平均61.5歲。所有患者術前未接受放化療。組織標本離體后迅速置于液氮中冷凍后置于-80℃保存。人肺癌細胞A549購于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；DMEM、胎牛血清及青鏈霉素雙抗購于美國Hyclone公司；模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-1271-5p模擬物(miR-1271-5p mimics)、小干擾RNA陰性對照(si-NC)、FSCN1小干擾RNA(si-FSCN1)、空載體質粒(pcDNA)、FSCN1過表達載體(pcDNA-FSCN1)、含FSCN1 3′UTR的野生型熒光素酶報告基因載體(WT-FSCN1)或突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-FSCN1)由上海生工生物工程有限公司提供；四甲基偶氮唑藍(MTT)細胞活力檢測試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于上海碧云天生物技術公司；Transwell小室和基質膠購于美國BD公司；鼠源FSCN1抗體、兔源細胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于美國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人肺癌細胞A549用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基在37℃、5%CO2細胞培養箱進行培養，取對數期長勢良好的細胞進行后續實驗。

1.2.2細胞轉染和實驗分組 將A549細胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板，按照脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000使用說明分別將miR-NC、miR-1271-5p mimics、si-NC、si-FSCN1分別轉染至A549細胞，依次記為miR-NC組、miR-1271-5p組、si-NC組、si-FSCN1組，轉染成功后，檢測細胞活力、遷移侵襲能力及相關蛋白表達水平。為證實miR-1271-5p是通過下調FSCN1表達進而影響A549細胞的增殖、遷移和侵襲，將miR-1271-5p mimics分別與pcDNA-FSCN1、pcDNA共轉染至A549細胞，依次記為miR-1271-5p+pcDNA組、miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1組，檢測A549細胞的增殖、遷移和侵襲能力變化。

1.2.3RT-qPCR檢測miR-1271-5p和FSCN1 mRNA的表達水平 待細胞按照上述分組進行干預后，收集各組細胞，用Trizol試劑提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA的濃度和純度，使A260與A280比值為1.8～2.1之間。按照逆轉錄試劑盒合成cDNA，并以其為擴增模板進行RT-qPCR。分別以U6和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參，運用2-ΔΔCt法分析miR-1271-5p和FSCN1 mRNA的表達水平。引物序列如下：U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；GAPDH上游引物5′-TCAACGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′，下游引物5′-GCTGGTGGTCCAGGGGTCTTACT-3′；miR-1271-5p上游引物5′-CTTGGCACCTAGCAAGCAC-TCA-3′，下游引物5′-GCGAGCACAGAATTAATAC-GAC-3′；FSCN1上游引物5′-TCAGAGCTCTTCCTCATGAAGCT-3′，下游引物5′-GTCCAGTATTTGCCTGTGGAGTC-3′。

1.2.4MTT實驗檢測細胞活力 將A549細胞按照1×104個/孔的密度接種于96孔板，按照上述細胞分組進行相應轉染后，分別在轉染24、48、72 h時向每孔加入20 μl的MTT試劑，培養箱避光孵育4 h，小心棄去上清液，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶解，振蕩10 min，使用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度值。

1.2.5Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 侵襲實驗：將基質膠(50 mg/L)按照1∶8稀釋后鋪于小室內風干后備用。將小室至于24孔板中。收集轉染48 h的各組細胞，消化后，無血清細胞培養基調整細胞濃度。向小室內加入300 μl細胞數約為5×104個細胞懸液，24孔板下室加入600 μl含20%胎牛血清的培養基，37℃孵育24 h，棉簽擦去未過膜細胞，4%多聚甲醛室溫固定10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后，結晶紫染色5 min，PBS清洗后，將小室倒置于顯微鏡下拍照，隨機選取5個視野拍照，記錄細胞總數，取均值為侵襲細胞數。遷移實驗采用未包被基質膠的小室，其他步驟同侵襲實驗。

1.2.6Western印跡檢測FSCN1、CyclinD1、p21、MMP-2和MMP-9表達水平 待細胞按照上述分組進行干預后，收集各組細胞，加入細胞裂解液于冰上作用30 min。12 000 r/min離心30 min收集上清液，利用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白與上樣緩沖液混合后100℃變性3 min。每孔道加入30 μg細胞蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離細胞蛋白。將所有已分離的細胞蛋白電轉至硝酸纖維素膜。將膜至于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。洗膜后，將膜置于Ⅰ抗稀釋液中4℃孵育過夜，洗膜后，將膜至于Ⅱ抗稀釋液中室溫孵育2 h。洗膜后，將膜至于顯色液中進行避光顯色，Imagel J軟件分析目的蛋白的表達水平。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 StarBase預測顯示miR-1271-5p與FSCN1的3′UTR區域存在部分連續互補的核苷酸序列，推測FSCN1是miR-1271-5p的靶基因并進行驗證。將miR-1271-5p mimics、miR-NC分別與WT-FSCN1或MUT-FSCN1共轉染至A549細胞，轉染48 h檢測細胞熒光素酶活性變化。同時將miR-NC、miR-1271-5p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-1271-5p共轉染至A549細胞，轉染48 h，按照1.2.6步驟檢測FSCN1蛋白的表達水平。

1.3統計學方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1miR-1271-5p和FSCN1在肺癌組織中的表達 與癌旁組織比較，肺癌組織中miR-1271-5p的表達水平顯著降低，FSCN1 mRNA和FSCN1蛋白的表達水平顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

2.2miR-1271-5p過表達對肺癌A549細胞增殖的影響 與miR-NC組比較，miR-1271-5p組A549細胞miR-1271-5p的表達水平顯著升高，細胞在48、72 h細胞活力顯著降低，CyclinD1蛋白表達顯著降低，p21蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖2、表2。

表1 miR-1271-5p和FSCN1在 肺癌組織中的表達

圖1 FSCN1蛋白表達

圖2 增殖相關蛋白表達

表2 miR-1271-5p過表達對肺癌A549細胞增殖的影響

2.3miR-1271-5p過表達對肺癌A549細胞遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-1271-5p組A549細胞遷移和侵襲細胞數目顯著減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 遷移侵襲相關蛋白表達

2.4干擾FSCN1表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-FSCN1組A549細胞FSCN1蛋白表達顯著降低，細胞在48、72 h細胞活力顯著降低，遷移和侵襲細胞數目顯著減少，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達水平顯著降低，p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4、表4。

表3 miR-1271-5p過表達對肺癌A549 細胞遷移、侵襲的影響

圖4 FSCN1和增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

表4 干擾FSCN1表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.5miR-1271-5p靶向調控FSCN1的表達 采用生物信息學分析工具StarBase進行靶基因預測發現miR-1271-5p與FSCN1的3′UTR區域存在部分連續互補的核苷酸序列，見圖5A。雙熒光素酶報告實驗顯示，相較于miR-NC和WT-FSCN1共轉染組，miR-1271-5p mimics和WT-FSCN1共轉染組A549細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；相較于miR-NC和MUT-FSCN1共轉染組，miR-1271-5p mimics和MUT-FSCN1共轉染組A549細胞熒光素酶活性無統計學差異(P>0.05)，見表5。與miR-NC組(0.59±0.05)比較，miR-1271-5p組A549細胞FSCN1蛋白表達水平(0.23±0.03)顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組(0.57±0.06)比較，anti-miR-1271-5p組A549細胞FSCN1蛋白表達水平(0.95±0.08)顯著升高(P<0.05)，見圖5B。提示miR-1271-5p靶向負性調控FSCN1表達。

A:FSCN1的3′UTR中含有與miR-1271-5p互補的核苷酸序列；B：FSCN1蛋白表達；1，2：anti-miR-NC組，anti-miR-1271-5p組圖5 miR-1271-5p靶向調控FSCN1的表達

表5 雙熒光素酶報告實驗

2.6FSCN1過表達逆轉了miR-1271-5p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的作用 與miR-1271-5p+pcDNA組比較，miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1組A549細胞FSCN1蛋白表達水平顯著升高，細胞在48、72 h細胞活力顯著升高，遷移和侵襲細胞數目顯著增加，CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達水平顯著升高，p21蛋白的表達水平顯著降低(P<0.05)。見表6、圖6。

表6 FSCN1過表達逆轉了miR-1271-5p過表達對肺癌A549細胞增殖、遷移、侵襲的作用

1～2：miR-1271-5p+pcDNA組; miR-1271-5p+pcDNA-FSCN1組圖6 FSCN1和增殖、遷移、侵襲相關蛋白表達

3 討 論

miRNA調控多種細胞增殖、轉移等生理病理過程，其表達異常與癌癥發生密不可分。已報道多種miRNA在肺癌中表達異常，與肺癌細胞的增殖、轉移和耐藥有關。Yan等〔8〕研究發現miR-24-3p在肺癌中表達上調促進肺癌細胞的增殖和遷移及小鼠異種移植腫瘤生長；Wu等〔9〕指出miR-195高表達與非小細胞肺癌患者預后不良關系密切，miR-195高表達可提高非小細胞肺癌細胞的放射敏感性；Li等〔10〕發現miR-182在轉移性非小細胞肺癌中經常下調，上調miR-182可抑制腫瘤遷移、侵襲及上皮間質轉化。

研究指出miR-1271-5p在肝癌組織中呈低表達，與腫瘤大小，腫瘤淋巴結轉移分期和血管侵犯相關，過表達miR-1271-5p可抑制肝癌細胞的生長和遷移，miR-1271-5p是肝癌治療的潛在策略〔11〕；在急性髓細胞白血病中miR-1271-5p顯著下調，miR-1271-5p過表達可抑制白血病細胞增殖，誘導細胞凋亡，是急性髓細胞白血病預后標志物〔12〕；此外，miR-1271-5p的異常表達與結腸癌細胞對布羅莫結構域抑制劑JQ1的耐藥有關〔13〕。本研究結果提示miR-1271-5p可抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

FSCN1是一種55 kD的肌動蛋白結合蛋白，與絲狀足和肌動蛋白為基礎的突起形成相關，促進細胞運動、遷移和侵襲。在正常上皮細胞中FSCN1表達缺失或低表達，但在上皮性卵巢癌〔14〕、結直腸癌〔15〕等多種惡性腫瘤中FSCN1表達上調。此外，研究證實干擾FSCN1表達可抑制胰腺癌〔16〕、肝癌〔17〕細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡。與前人〔7〕研究發現一致，本研究結果提示miR-1271-5p通過靶向FSCN1在肺癌中發揮抑癌基因作用。miR-200b〔18〕、miR-145〔19〕等多種miRNA通過靶向下調FSCN1抑制肺癌的遷移、侵襲支持了本研究觀點。

綜上，miR-1271-5p在肺癌中表達下調，FSCN1表達上調。上調miR-1271-5p通過靶向FSCN1抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，miR-1271-5p有望成為肺癌診斷和治療的有效靶點。