鼠李糖桿菌通過干預炎性反應治療大鼠缺血性腦損傷

邵延萱 羅文哲 崔延昆 張雪松 盛延良 殷悅

(佳木斯大學 1臨床醫學院,黑龍江 佳木斯 154007；2基礎醫學院)

腦卒中是發病突然的一類因腦血液循環障礙所引起的疾病，死亡率為60.0%。其中，因缺血所引起的腦卒中約占所有腦卒中病例的87.0%。腦組織缺血性死亡可引起炎癥和腦水腫，預后惡化。研究表明多種疾病，如血栓形成、心血管系統疾病、哮喘、肥胖、結腸炎、結腸癌及一些精神疾病和神經退行性疾病，均可由腸道菌群失調而引起。而腦腸軸雙向作用機制的提出，為腸道微生物與腦血管病之間的研究提供了有力的科學支撐，腸道微生物菌群與腦之間可能存在多種方式進行聯系及相互影響〔1〕。本研究旨在從益生菌調整腸道微生態學角度闡明缺血性腦損傷與炎癥的關系及潛在的調控機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 SPF級SD雄性大鼠〔(240±20)g，9周齡〕由佳木斯大學實驗動物中心機構提供。在溫度23～25℃，濕度13%，氧氣充足條件下飼養。所有動物研究按照佳木斯大學實驗動物中心機構動物倫理關懷委員會批準的方案和指南進行。

1.1.2材料與儀器 水合氯醛、酒精、二甲苯、蘇木素、伊紅、磷酸鹽緩沖液(PBS)等(北京化學試劑六廠)；目的蛋白及內參一抗(CST公司)；鼠李糖桿菌(山東中科嘉億生物工程有限公司)；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢酶免生物科技有限公司)。電泳儀、恒溫水浴鍋(北京六一儀器廠)；圖像采集系統(萊卡顯微鏡)；離心機(上海知正離心機公司)；切片機、封片機(新鄉市維克科教儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組 選取15只大鼠(200～250 g)，隨機分為3組，每組5只，分別為：假手術組(A組，所做切口不結扎+生理鹽水)；頸動脈結扎+生理鹽水組(B組)；頸動脈結扎+鼠李糖桿菌組(C組)。建模后飼養14 d，給予足夠飲食與水，每天監測體重。

1.2.2缺血腦損傷動物模型 麻醉大鼠(10%水合氯醛，3 ml/kg)，平臥，固定，頸部行縱向切口。分離胸鎖乳突肌，暴露右側頸總動脈、頸內動脈、頸外動脈，分別隔離。用6-0絲線在兩側頸總動脈進行結扎，為了保證效果，在動脈的遠端和近端進行雙重處理；A組僅做切口與分離處理，但并不進行結扎，傷口用碘消毒并縫合。腦缺血模型建立后，大鼠出現雙目失明和繞圈行走，不能直線行走。根據Longa評分法〔2〕評價測試結果為3分，表明成功建立腦缺血模型，能夠模擬缺血性腦卒中的疾病狀態。動物模型構建成功后采外周血，離心并進行低溫保存。取小腸，腸標本的采集于各組規定時間進行解剖開腹取小腸，采用0.9%氯化鈉進行沖洗，再進行固定。取腦組織，一部分在甲醛溶液內固定，用于組織形態學檢測；一部分-80℃凍存，用于后期檢測分析。

1.2.3ELISA 取2 ml外周血離心，離心時間20 min，離心速度3 500 r/min，將每支試管中上清液取出，-20℃保存。根據ELISA試劑盒說明書，檢測腦及腸中腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β及外周血中血栓素(TX)B2水平。

1.2.4石蠟切片的制作 取大鼠大腦及小腸部，用FAA液進行固定，流水沖洗。乙醇低到高濃度梯度脫水，二甲苯+無水酒精混合液透明1 h。將材料放入溶解的純蠟中，時間為30 min，該過程再重復2次。包埋機器包埋組織塊，實驗前切片。

1.2.5免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟。3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。5%～10%正常山羊血清(PBS 稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2 h或4℃過夜。PBS沖洗，滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30 min。PBS沖洗，滴加適量的辣根過氧化物酶，37℃孵育10～30 min。PBS沖洗，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑顯色3～15 min，自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、封片。腦組織樣本進行免疫組化檢測Toll樣受體(TLR)4、髓樣分化因子(MyD)88、核因子(NF)-κB、內皮細胞閉合蛋白(occludin)、緊密連接蛋白(Clandin)-1、閉鎖小帶蛋白(ZO)-1。腸組織樣本進行免疫組化檢測Occludin、Clandin-1、ZO-1。

1.2.6Western印跡 將組織與裂解液按照100 mg∶1 ml的比例進行處理，保持低溫，快速勻漿，4℃ 12 000 r/min離心5 min，取部分上清液進行定量，加結合緩沖液95～100℃處理5 min，冷凍保存或上樣。電泳-轉膜-封閉-一抗過夜-TBST清洗-二抗室溫1 h-TBST清洗-化學發光成像。

1.3統計學分析 采用Graphpad Prism9.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1各組炎性因子水平比較 A組外周血TXB2及腦和腸中TNF-α、IL-1β水平均顯著低于B組，B組外周血TXB2及腦和腸中TNF-α、IL-1β水平均顯著高于C組(P<0.05)。見表1。

表1 各組炎性因子水平比較

2.2各組TLR4-NF-κB信號通路相關蛋白水平比較 A組TLR4、NF-κB、MyD88水平均顯著低于B組，B組TLR4、NF-κB、MyD88水平均顯著高于C組(P<0.05)。見表2、圖1。

2.3各組腦及腸組織中緊密連接蛋白水平比較 腦及腸組織中Occludin、Clandin-1、ZO-1水平比較：A組>C組>B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3、表4、圖2、圖3。

表2 各組TLR4-NF-κB信號通路相關蛋白 水平比較

圖1 腦部TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(免疫組化，×400)

表3 各組腦組織中緊密連接蛋白水平比較

表4 各組腸組織中緊密連接蛋白水平比較

圖2 腦部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫組化，×400)

圖3 腸部ZO-1、Occludin、Clandin-1水平(免疫組化，×400)

3 討 論

缺血性腦損傷由于供血異常而引起機體供氧量異常及新陳代謝會發生變化〔3〕，小神經膠質細胞是中樞神經系統的巨噬細胞，當被激活后，可釋放大量炎癥和細胞毒性介質，這些介質與神經功能障礙和腦損傷有關〔4〕。小膠質細胞表達的TLRs是模式識別受體的一個亞家族，識別入侵的病原體和內源性有害刺激，從而誘發先天性和適應性免疫反應〔5〕。其中TLR4是常見的研究對象，通過介導NF-κB信號通路，進而影響炎性因子的表達。研究證明脂多糖(LPS)等炎性因子與TLR4結合，通過MyD88途徑介導炎癥〔6〕。活化的TLR結構域結合MyD88形成TLR-MyD88復合體，導致下游蛋白IRAK1和TRAF6的磷酸化，激活NF-κB信號通路并進入細胞核調節相關基因表達。研究證明胡椒堿通過抑制NF-κB信號通路中 kappa 光多肽核因子增強子的表達，進而抑制促炎性細胞因子的表達〔7〕。

血腦屏障(BBB)的內皮細胞與緊密連接蛋白相互接觸，包括Occludin，ZO-1和Claudins，它們與相鄰的內皮細胞相互作用，形成阻止細胞旁擴散的物理屏障〔8〕。可以說BBB的功能依賴于緊密連接蛋白的完整性。本研究結果表明腸屏障(IB)和BBB的通透性變大。炎性因子表達的增強與緊密連接蛋白的表達下降綜合考慮可推測炎性因子的存在，導致IB、BBB產生相應的變化。Chen等〔9〕血管周圍 M1樣小膠質細胞誘導的內皮細胞壞死導致發現BBB受損，需要 M1型小膠質細胞分泌TNF-α及其受體TNFR1介導。腸道細菌可影響中樞神經系統(CNS)的生理功能和炎癥的發生〔10〕。

研究顯示導致潰瘍性結腸炎(UC) 癌變的一個可能原因是上皮細胞損傷和修復的重復周期〔11〕。在這個過程中可產生過多的促炎癥細胞因子，如TNF-α和IL-6。腸道微生物群可以影響 UC的發生〔12〕，因為它誘導了持續性腸道炎癥。益生菌被用作UC 患者的補充劑，對 UC的治療效果顯著〔13，14〕。可見菌群與炎性因子的產生存在相關作用的可能。

綜上，缺血性腦損傷改變了腸道微生物群的組成，而益生菌可通過調節免疫反應降低缺血性腦損傷的損害。