連翹苷調控miR-146a對脂多糖誘導的腎小管上皮細胞HK-2凋亡及氧化應激的影響

梁勇 武軍元 劉禹賡 劉波 魏兵 張向群 曾紅

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院 1西區急診科，北京 100043;2急診科)

急性腎損傷(AKI)是膿毒癥最常見、最嚴重的并發癥之一，發病率及死亡率較高，重癥監護病房住院患者中約50%的AKI由膿毒癥引起〔1〕。脂多糖(LPS)是主要的內毒素之一，其通過誘導氧化應激、炎癥反應，凋亡在膿毒癥相關AKI發病中具有重要作用〔2〕。AKI可引起腎小管上皮細胞凋亡，而細胞凋亡又進一步促進AKI進展。因此，有效減輕LPS誘導的腎小管上皮細胞凋亡和氧化應激損傷對AKI治療具有重要意義。連翹苷為中藥連翹的主要藥理成分，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗過敏、抗腫瘤等多種藥理活性。研究證實連翹苷可減輕急性肺損傷肺組織病理損傷程度，抑制炎癥反應〔3〕。連翹苷還可改善膿毒癥大鼠機體炎癥反應、微血管凝血及血管內皮細胞損傷等因素，提高大鼠存活率〔4，5〕。miR-146a是許多心血管疾病的保護因子，上調miR-146a表達可減弱阿霉素誘導的心臟毒性，改善膿毒癥誘導的心肌功能障礙〔6，7〕。AKI小鼠腎組織中miR-146a表達降低，褪黑素通過抑制炎癥反應，對AKI具有明顯治療作用〔8〕。本研究旨在探討連翹苷對LPS誘導的腎小管上皮細胞HK-2凋亡、氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1細胞和試劑 人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2購于武漢普諾賽生命科技公司；miR-146a模擬物(mimics)、miR-146a抑制物(inhibitor)、細胞計數試劑盒(CCK)-8、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡檢測試劑盒購于上海生工公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購于北京寶日醫生物公司；兔源B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl相關X蛋白(Bax)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購于美國CST公司；丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)活性檢測試劑盒購于北京索萊寶生物公司。

1.2細胞培養和實驗分組 HK-2細胞采用補充10%胎牛血清、1%青鏈霉素雙抗的MEM培養基在含5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養。細胞70%融合時，按照1∶4比例轉移細胞至新的培養瓶培養，換液頻率為每周2～3次。采用1 μg/ml LPS干預對數期HK-2細胞6 h記為模型(Model)組〔9〕。Con組正常培養細胞，不用LPS干預。采用5、10、20 ng/ml的連翹苷分別處理LPS誘導的HK-2細胞24 h，依次記為實驗1組、實驗2組、實驗3組。脂質體轉染法將miR-146a mimic轉染HK-2，轉染48 h后進行LPS干預處理記為Model+miR-146a mimic組。將miR-146a inhibitor轉染HK-2，轉染48 h后進行LPS干預處理6 h，然后用20 ng/ml的連翹苷處理24 h，記為實驗3+miR-146a inhibitor組。

1.3實時熒光定量-PCR檢測miR-146a表達 TRIzol試劑提取各組HK-2細胞的總RNA，隨后用逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒進行逆轉錄和RT-qPCR。2-ΔΔCt法計算miR-146a相對表達量。miR-146a上游引物5′-GCAGGGTCCGAGGTATTCG-3′，下游引物5′-CGCGTGAGAACTGAATTCCAT-3′；內參U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4CCK-8法檢測細胞活力 將各組細胞以每孔2×105個細胞的密度接種96孔板，貼壁后每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養箱繼續孵育2 h后，酶標儀分析450 nm處各孔光密度(OD)值。

1.5流式細胞術檢測細胞凋亡 磷酸鹽緩沖液洗滌細胞2次，隨后用1×結合緩沖液調整細胞密度為1×105個/ml。在100 μl細胞懸液中各加入5 μl的Annexin V-FITC和PI進行暗室染色。補加400 μl的1×結合緩沖液混勻后上機檢測細胞凋亡率。

1.6Western印跡檢測Bcl-2和Bax蛋白表達 采用補充蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀試驗緩沖液提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸對總蛋白進行定量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品，濕法轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜置于含有5%脫脂牛奶的洗膜緩沖液中4℃封閉過夜，將膜與一抗室溫孵育2 h，將膜再與二抗室溫孵育1 h。加入化學發光試劑顯色，GAPDH作為內源性對照，Image J軟件對目的條帶灰度進行定量分析。

1.7試劑盒檢測細胞中MDA含量、SOD和GSH活性 收集各組細胞至離心管內，棄去細胞培養液，加入提取液超聲破碎細胞，離心收集上清液后置于冰上。按照MDA含量、SOD活性、GSH活性檢測試劑盒步驟測定各組HK-2細胞中MDA含量、SOD和GSH活性。

1.8統計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1連翹苷對LPS作用的HK-2細胞活性及miR-146a表達的影響 與Con組比較，Model組HK-2細胞miR-146a表達水平、OD值顯著降低(P<0.05)；與Model組比較，實驗2組、實驗3組HK-2細胞miR-146a表達水平、OD值顯著升高(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細胞miR-146a表達水平、OD值逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 連翹苷對LPS作用的HK-2細胞活性及 miR-146a表達的影響

2.2連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡的影響 與Con組比較，Model組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與Model組比較，實驗2組、實驗3組HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細胞凋亡率、Bax蛋白表達逐漸降低，Bcl-2蛋白逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

1～5：Con組、Model組、實驗1組、實驗2組、實驗3組圖1 連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表2 連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡的影響

2.3連翹苷對LPS作用的HK-2氧化應激的影響 與Con組比較，Model組HK-2細胞SOD和GSH水平顯著降低，MDA水平顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，實驗2組、實驗3組HK-2細胞SOD和GSH水平顯著升高，MDA水平顯著降低(P<0.05)。隨著連翹苷濃度的逐步增加，HK-2細胞SOD和GSH水平逐漸升高，MDA水平逐漸降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 連翹苷對LPS作用的HK-2氧化應激的 影響

2.4過表達miR-146a對LPS作用的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響 與Model組比較，過表達miR-146a后HK-2細胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平顯著升高，凋亡率、Bax、MDA水平顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

1，2：Model組、Model+miR-146a mimic組圖2 過表達miR-146a對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

表4 過表達miR-146a對LPS作用的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響

2.5抑制miR-146a可逆轉連翹苷對LPS作用的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響 與實驗3組比較，實驗3+miR-146a inhibitor組HK-2細胞OD值、Bcl-2、SOD和GSH水平顯著降低，凋亡率、Bax、MDA水平顯著升高(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 抑制miR-146a可逆轉連翹苷對LPS作用的HK-2細胞活性、凋亡及氧化應激的影響

1，2：實驗3組、實驗3+miR-146a inhibitor組圖3 抑制miR-146a可逆轉連翹苷對LPS作用的HK-2凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

3 討 論

連翹苷為連翹的主要化學成分之一，具有清熱、解毒、散結排膿等功效，長期用于治療風熱感冒、發炎、淋病、丹毒和潰瘍〔10〕。研究顯示，連翹苷在急性肺損傷、AKI中具有潛在保護作用。Zhong等〔11〕研究顯示，連翹苷可顯著減輕LPS誘導的肺組織病理學改變，抑制肺泡出血、中性粒細胞浸潤及促炎細胞因子分泌，改善肺水腫。Zhang等〔12〕證實連翹苷可抑制活性氧產生、降低組織蛋白酶L和肝素酶在體內外表達水平，抑制炎性細胞因子分泌進而改善AKI小鼠腎臟功能。與上述保護作用一致，促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2之間的平衡是線粒體途徑調控細胞凋亡的關鍵，Bax表達增加和Bcl-2表達降低可誘導線粒體膜孔形成，促進凋亡蛋白釋放進而誘導細胞凋亡〔13〕。氧化應激在誘導細胞凋亡中起重要作用。本研究結果提示連翹苷可提高HK-2細胞的抗氧化應激能力進而減輕LPS誘導的氧化應激損傷。

miRNA是轉錄后基因表達的負調控因子，其通過與靶mRNA的序列特異性結合導致翻譯抑制或mRNA降解與心血管疾病、癌癥和腎臟疾病等多種疾病的發生和發展有關〔14〕。研究顯示miR-146a表達降低與缺氧誘導的心肌細胞損傷〔15〕、肝缺血再灌注損傷〔16〕、LPS誘導的急性肺損傷〔17〕有關。糖尿病腎病患者腎小球中miR-146a表達降低〔18〕。干擾肺腺癌轉移相關轉錄本(MALAT)1表達通過上調miR-146a顯著抑制炎性細胞因子分泌和免疫反應，增加細胞活力，減輕LPS誘導AKI〔19〕。此外，白藜蘆醇、雷公藤甲素通過上調miR-146a表達對LPS誘導的小膠質細胞BV2、HaCaT細胞的炎癥損傷具有保護作用〔20，21〕。本研究結果提示連翹苷對LPS誘導的HK-2細胞凋亡和氧化應激損傷的保護作用可能與miR-146a增加有關。進一步驗證miR-146a功能顯示，過表達miR-146a顯著增加HK-2細胞活力，提高SOD、GSH活力，降低MDA含量，減弱LPS誘導的HK-2細胞凋亡，與連翹苷的保護作用一致。此外，抑制miR-146a顯著降低20 ng/ml連翹苷預處理對LPS誘導的HK-2凋亡和氧化應激損傷的影響。這說明連翹苷通過上調HK-2細胞中miR-146a表達進而減輕LPS誘導的細胞凋亡和氧化應激損傷。