UPLC-MS/MS 測定豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的研究

朱小嬌，張 亮，張碧宇，項林敏，周建峰

（溫州市質量技術檢測科學研究院，浙江溫州 325000）

0 引言

市場上部分蔬菜水果在種植、流通和銷售環節中存在比較嚴重的抗生素殘留問題，其中在多批次豆芽類樣品抽檢中，喹諾酮類和甲硝唑類抗生素的快篩結果呈陽性[1-11]。經室外試驗，恩諾沙星呈陰性豆芽在次日開始腐爛，而相對的陽性豆芽除了根部自然風干，在10 日后仍保持新鮮。《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》和《豆芽衛生標準》2 個標準中均未規定喹諾酮類和硝唑等抗生素可以添加使用，可知該非法違規添加抗生素行為，目的在于抗菌保鮮，以牟取非法利益。

國內外關于檢測動物源中抗生素類藥物文獻的方法眾多[12-14]，檢驗方法已經較成熟，關于獸藥在蔬菜中的殘留檢測報道卻較少。其中，吳小蓮[8]開發的檢測過程較為復雜，試劑成本高，后期產生的有害有機廢液多，不適合用于批量樣品的檢測。劉暢[7]運用QuEChERS 快速凈化測定法只限于喹諾酮類抗生素。試驗利用UPLC-MS/MS 液相色譜串聯質譜，建立一種準確測定豆芽中抗生素殘留的方法，能夠對豆芽類中的16 種硝唑和喹諾酮類抗生素，進行準確定性和定量，可操作性強。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈中11 種喹諾酮混標（100 μg/mL），美國A ChemTek.Inc 公司提供；乙腈中5 種硝基咪唑混標（100 μg/mL），德國Dr.Ehrenstorfer 公司提供；諾氟沙星- D5（99.7%，5 mg），上海安譜公司提供；羥甲基甲硝咪- D3（99.9%，10 mg），德國WITEGA 公司提供；無水硫酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；萃取鹽包（4 g 無水硫酸鎂和1.5 g無水乙酸鈉）、凈化管、乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純），上海安譜公司提供；乙酸銨（色譜純），美國Sigma 公司提供。

1.2 儀器和設備

Agilent1290/6470 型三重四極桿液相色譜-串聯質譜，配ESI 源，美國安捷倫公司產品；IKA MS3 型渦旋振蕩器，德國IKA 公司產品；SIGMA 3K15 型冷凍離心機（轉速≥5 000 r/min），美國Sigma 公司產品；氮吹儀、針式濾器（0.22 μm） 有機相微孔濾膜，上海安譜公司產品；Research Plus 微量移液器，德國艾本德公司產品；Millipore 超純水處理系統，美國Millipore 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

（1） 混合標準物質中間液（2 000 ng/mL）。分別準確移取200 μL 混合標準儲備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（2） 混合內標中間液（2 000 ng/mL）。分別準確移取200 μL 內標儲備液10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。

（3） 臨用時，用空白樣品前處理所得基質溶液配制成質量濃度為5，10，20，40，60，80，100 ng/mL的混合標準工作液，繪制標準曲線（內標的質量濃度為50.0 ng/mL）。

1.3.2 試樣的制備與保存

將樣品500 g，充分均質振搖混勻，分裝至潔凈容器內作為試樣，于-18 ℃以下保存。

1.3.3 檢測樣品制備稱取5 g（精確到0.01 g） 樣品，放入50 mL 離心管中，準確加入25 μL 混合內標液，避光放置10 min。加入20 mL 酸化乙腈，渦旋混合3 min，再加入4 g

無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉，渦旋混勻，以轉速12 000 r/min 離心5 min，使兩相分層，取上層乙腈溶液，過無水硫酸鈉后收集在梨形瓶中，以40℃旋蒸近干，用乙腈定容至1.0 mL，加入凈化粉末渦旋混勻1 min，以轉速10 000 r/min 離心5 min，上清液過0.22 μm 有機相濾膜過濾后，待測定。

1.3.4 色譜條件

Zorbax Eclipse Plus C18型色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美國安捷倫公司產品），液相流速0.2 mL/min，柱溫箱溫度35 ℃，進樣體積2 μL，流動相A：甲醇，流動相B：水（含0.1%甲酸和5 mmoL/L 乙酸銨）。

液相色譜流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相梯度洗脫程序

1.3.5 質譜條件

離子源：ESI 電離源，正離子模式，離子源溫度350 ℃，質譜毛細管電壓4 500 V，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流速11 L/min，霧化器壓力45 psi，監測模式：多反應監測（MRM）。

16 種硝唑和喹諾酮類抗生素的多質譜參數見表2。

表2 16 種硝唑和喹諾酮類抗生素的多質譜參數

1.3.6 化合物MRM 離子圖

化合物MRM 離子圖見圖1。

圖1 化合物MRM 離子圖

1.3.7 數據處理

通過Masshunter 工作站及數據處理系統采集分析質譜圖，內標定量，采用Excel 2007 進行數據表格和圖表處理。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理優化

2.1.1 萃取相物質的選擇

試驗以回收率作為評價參數，測試乙酸乙酯、酸化乙酸乙酯、乙腈、酸化乙腈4 種萃取試劑的提取效果，測試步驟參照上文。

在樣品加標后，靜置1 h，以萃取回收率對4 種有機試劑的提取效果進行比較。測試過程中，以酸化乙腈作為萃取液，提取效果優于純乙腈相，尤其是對諾氟沙星- D5的提取效果降低得顯著；使用乙酸乙酯和酸化乙酸乙酯的萃取效果，對喹諾酮響應抑制明顯，因此選擇酸化乙腈作為萃取試劑。測試中，為了延長不穩定化合物的穩定性，使用乙酸將乙腈酸化。酸性萃取劑使目標化合物變成分子狀態，免除了酸性化合物的水解效應，在萃取過程中增加了酸性化合物及易受基質干擾物質的回收率。

2.1.2 萃取鹽包的選擇

由于豆芽含水量較高，蛋白含量不低，組合式的無水硫酸鎂和無水乙酸鈉相較于單獨的氯化鈉來說，鹽析分層效果更好。而在考查不同比例的無水硫酸鎂和無水乙酸鈉組合后，參考數據發現4 g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉的組合效果較好。

2.1.3 凈化過程的選擇

以固相萃取凈化方式凈化，首先考慮的是使用HLB 凈化小柱，但豆芽的物質組成中油脂含量不高，不存在去油問題，且在利用HLB 小柱固相萃取凈化時，需要不斷活化洗脫步驟，試劑廢液產生量較多、耗時長，而HLB 固相小柱成本相對較高，所以排除使用固相萃取凈化法。

在通過酸化乙腈提取后，考查不同含量凈化管，即無水硫酸鎂和C18組合的凈化效果，通過平行加標試驗比較回收率。凈化管組合分為I 類凈化管（150 mg 無水硫酸鎂+ 2.5 mg GCB + 25 mg PSA）、II類凈化管（150 mg 無水硫酸鎂+ 7.5 mg GCB + 25 mg PSA）、III 類凈化管（150 mg 無水硫酸鎂+ 30 mg GCB + 25 mg PSA）、IV 類凈化管（150 mg 無水硫酸鎂+50 mg GCB +50 mg PSA）。按上文進行加標制備試驗，在樣品完成加標后靜置，以試驗回收率對4 種凈化管的萃取效果進行比較。

豆芽中4 類凈化粉末的凈化平均提取回收率比較見如圖2。

圖2 豆芽中4 類凈化粉末的凈化平均提取回收率比較

GCB，PSA 在抗生素殘留檢測前處理方法中是效果較好的凈化吸附劑。PSA 兼具極性相互作用和較弱的陰離子交換作用，可有效從非極性樣品中除去極性物質，如糖類干擾物、有機酸、脂肪酸、極性色素等。GCB 主要用來除去疏水性物質，但是2 種吸附劑的使用比例不同也會一定程度上影響對目標物的回收提取效果，依據測試數據選定以III 類凈化組合作為凈化組分。

2.1.4 定容試劑的選擇

在確定了提取凈化方式后，最后的定容液試劑比較了甲醇、酸化甲醇、乙腈、酸化乙腈的定容效果，分別對樣品進行平行加標試驗，乙腈的效果較其他好，故選用乙腈。

2.2 標準曲線、回收率及精密度

配制混合標準工作使用液，以MRM 的分析模式進行測定，制作標準曲線，數據顯示：目標化合物質量濃度含量在10~1 000 ng/mL 內可以得到良好線性，曲線系數均高于0.99。以豆芽為樣品進行加標回收試驗，在1，2，20 μg/kg 的加標水平下，以測試方法萃取、凈化制備樣品分析測試，計算平均線性和回收率，目標化合物的回收率為60%~120%。

5 種硝唑和11 種喹諾酮抗生素的檢出限、線性回歸方程和加標水平的回收率及精密度見表3。

表3 5 種硝唑和11 種喹諾酮抗生素的檢出限、線性回歸方程和加標水平的回收率及精密度

2.3 實際樣品的測定

試驗依據開發的方法對市售綠豆芽、黃豆芽等120 批次進行抗生素殘留檢測，檢出含恩諾沙星8 批，含量為10.2~112.3 μg/kg；氧氟沙星2 批，含量為7.8 μg/kg和42.4 μg/kg；甲硝唑2 批，含量為38.0 μg/kg 和41.7 μg/kg。陽性樣品與浙江省市場監督管理局制定的《關于加強生豬產品、豆芽等重點食品農產品排查治理工作的緊急通知》附件2 檢測結果進行比較，結果一致。結果表明，該方法前處理更加簡單準確，陽性檢出率與標準方法檢出率一致，適用于豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的分析檢測。

3 結論

通過對豆芽中抗生素藥物殘留所使用的萃取溶劑，萃取方法及關鍵色譜參數條件進行優化研究，成功建立了一種快速檢測的液相串聯質譜測定方法，在5~100 μg/L 范圍內具有較好的線性關系，相關系數均大于0.99，加標水平在1，2，20 μg/kg 時，16 種抗生素的回收率在60%~120%，相對標準差系數小于15%。該方法適用于豆芽中16 種硝唑和喹諾酮類抗生素殘留的分析檢測。通過該方法能夠對市場上的豆芽抗生素殘留做到有效監測，對于整個食品行業安全也具有非常重要的價值，應用前景廣闊。在沒有明確的國家標準和行業標準的規范要求下，對行業檢測具有重要的風險監測意義，同時也能更好地維護消費者的健康權益。