莧菜AtrADH2基因克隆及表達分析

肖 昉 王 樂 鄭友峰 賴鐘雄 劉生財* 牟建梅

(1.福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所，福州 350002；2.蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 蘇州 215000)

莧菜(AmaranthustricolorL.)為雙子葉植物門石竹目莧科莧屬的1年生草本植物，是一種短日照植物，臨界光周期值為15 h[1]。在高溫短日照條件下可提前形成花原基進而開花[2]。作為一種優(yōu)質(zhì)蔬菜，莧菜中含有人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如鈣、膳食纖維、必需氨基酸[3]、蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和酚類等[4]，具有藥用價值和豐富的營養(yǎng)價值，以嫩莖葉為可食用部分，是一種無公害綠色食品。莧菜苗中除根外，其余部位含有豐富的甜菜色素，是獲得甜菜色素的重要來源之一。‘蘇莧1號’葉片玫紅色，莖桿淺紅色，葉片中具有豐富的甜菜色素，‘蘇莧2號’葉片淺綠偏黃，2個品種均具有生長周期短的特點[5-6]。

甜菜色素是一種含氮水溶性色素，其生物合成開始于酪氨酸的大量積累[7]。酪氨酸途徑是由莽草酸途徑的最終產(chǎn)物預(yù)苯甲酸鹽(Prephenate)合成[8]，在自然界中存在2條不同的途徑[9-10]，在絕大部分植物中，預(yù)苯酸經(jīng)轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生的預(yù)苯胺酸被認(rèn)為是酪氨酸合成的前體物質(zhì)[9]，預(yù)苯胺酸在預(yù)苯胺酸脫氫酶(Arogenate dehydrogenase，ADH/TyrAa)的脫氫和脫羧作用下直接生成酪氨酸[11]，ADH對酪氨酸的合成具有強烈的反饋抑制作用[12]。Lopez-Nieves等[13]發(fā)現(xiàn)在甜菜中BvCYP76ADα、BvDODAα、BvMYB1和BvADHα基因的存在與甜菜色素在甜菜中的分布密切相關(guān)，表明BvCYP76ADα、BvDODAα、BvMYB1和BvADHα基因?qū)μ鸩酥刑鸩松睾铣删哂猩险{(diào)作用；由ADH介導(dǎo)的Tyr(L-tyrosine)途徑對于植物的正常生長和發(fā)育必不可少，Oliveira等[12]通過敲除擬南芥AtADH2/TyrA2導(dǎo)致其葉片生長緩慢，抑制AtADH1/TyrA1基因的瞬時表達導(dǎo)致擬南芥花藥受損而降低了種子產(chǎn)量。

光周期影響植物體內(nèi)一些次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生[14-15]，次生代謝產(chǎn)物主要包括萜烯類、酚類和含氮化合物3大類。有研究表明，光周期有利于萜烯類物質(zhì)的積累如24 h白光處理有利于未成熟越橘漿果中類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因的表達[16]；也有利于酚類物質(zhì)的積累如較長光周期處理有利于海棠葉片和愈傷組織中花青素含量的積累及生物合成關(guān)鍵基因的表達[17]，但光周期調(diào)控甜菜色素生物合成的機制尚不明確。

本研究以‘蘇莧1號’‘蘇莧2號’莧菜品種為試驗材料，分析不同光周期條件和組織部位對莧菜甜菜色素含量的影響，同時，基于莧菜Blue-Dark轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(登錄號SRA：SRR11196359-SSR11196364)，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得莧菜AtrADH2基因的cDNA序列，并對其蛋白序列進行生物信息學(xué)分析，最后采用qRT-PCR技術(shù)檢測AtrADH2基因及甜菜色素代謝合成相關(guān)基因表達情況，旨在為進一步研究AtrADH2基因在甜菜色素代謝過程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料‘蘇莧1號’‘蘇莧2號’莧菜種子，由蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方法

1.2.1光周期處理

將30粒莧菜種子播種于培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)基質(zhì)為丹麥品式泥炭土，pH 5.5，分別在8 h/16 h、12 h/12 h、16 h/8 h和20 h/4 h(Light/Dark)光周期條件下進行生長，溫度為(25±1) ℃，光照強度為125 μmol/(m·s)，培養(yǎng)15 d(幼苗期)后取莧菜不同組織部位(葉和莖)樣品。

1.2.2不同組織部位處理

將30粒‘蘇莧1號’莧菜種子播種于培養(yǎng)基質(zhì)中，培養(yǎng)基質(zhì)為丹麥品式泥炭土，pH 5.5，放置在溫度為(25±1) ℃、光照強度為125 μmol/(m·s)、光周期條件為12 h/12 h條件下生長，培養(yǎng)45 d(開花期)后分別取莧菜不同組織部位(根、莖、葉和花)樣品。

所有樣品均在上午9：00—10：00取樣，用于甜菜色素含量測定及qRT-PCR表達分析，取樣后用液氮凍存置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.3莧菜總RNA提取及cDNA合成

取0.15 g莧菜處理材料，采用天漠微量RNA提取試劑盒(北京天漠科技開發(fā)有限公司，中國)進行RNA提取，采用超微量分光光度計(Thermo Electron Corp, USA)測定RNA的OD值和濃度，并使用1%瓊脂凝膠進行電泳檢測其完整性。采用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國)進行cDNA(500 ng)合成用于RT-PCR，采用Hifair Ⅲ 1 st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(上海翊圣生物科技有限公司，中國)進行cDNA(50 ng)合成用于qRT-PCR，所得cDNA模板置于-20 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗。

1.2.4莧菜AtrADH2基因克隆

根據(jù)關(guān)鍵詞“arogenate dehydrogenase”在莧菜Blue-Dark轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(登錄號SRA：SRR11196359-SSR11196364)檢索，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)FPKM值獲得1條ADH2序列(轉(zhuǎn)錄組編號：Unigene44099_All)并采用DNAMAN 9.0設(shè)計特異性引物(表1)，以‘蘇莧1號’‘蘇莧2號’cDNA為模板進行RT-PCR擴增，25 μL體系為cDNA(50 ng)模板1 μL，AtrADH2-ORF-F/R 1 μL，TapMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。RT-PCR程序設(shè)定為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共重復(fù)35個循環(huán)，最后72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂凝膠電泳后切膠回收，采用膠回收試劑盒進行純化回收，將回收后的目的片段與pMD18-T進行連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，經(jīng)菌液PCR后選擇陽性克隆測序。

1.2.5莧菜AtrADH2蛋白生物信息學(xué)分析

莧菜AtrADH2基因氨基酸序列、核苷酸序列同源性和不同物種間的ADH蛋白序列通過NCBI-Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析；AtrADH2蛋白序列分別采用在線軟件進行預(yù)測分析：理化性質(zhì)ExPASy Protparam(https:∥web.expasy.org/protparam/)，蛋白結(jié)構(gòu)域NCBI-CDS(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，功能位點(https:∥prosite.expasy.org/)，二級結(jié)構(gòu)SPOMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/)，三級結(jié)構(gòu)SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)，亞細(xì)胞定位WoLF PSORT(https:∥wolfpsort.hgc.jp)；采用MEGA 5.0鄰接法(Neighbor-joining)進行不同物種間ADH蛋白系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，參數(shù)重復(fù)值設(shè)置為1 000。

1.2.6莧菜甜菜色素含量測定

取液氮研磨后的樣品0.05 g用1.5 mL預(yù)冷無水乙醇4 ℃提取30 min，4 ℃離心10 min(10 000 r/min)；棄上清，用預(yù)冷蒸餾水重懸沉淀后4 ℃提取30 min，4 ℃離心10 min(10 000 r/min)；取上清液冰上待測。采用紫外分光光度計分別在538 nm和465 nm處測定甜菜紅素和甜菜黃素的吸光值，3次生物學(xué)重復(fù)。計算甜菜紅素和甜菜黃素含量公式如下：

式中：C為甜菜色素含量，mg/g；A為吸光值；DF為稀釋倍數(shù)；M為甜菜色素的相對分子質(zhì)量(M甜菜紅素=550 g/mol、M甜菜黃素=308 g/mol)；ε為甜菜色素的摩爾吸光系數(shù)[ε甜菜紅素=60 000 L/(mol·cm)、ε甜菜黃素=48 000 L/(mol·cm)]；L為比色皿厚度，cm；V為提取液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.7實時熒光定量PCR表達分析

根據(jù)AtrADH2基因(GenBank登錄號：MT982371)和甜菜色素代謝途徑相關(guān)基因AtrCYP76AD1(GenBank登錄號：KY792593)、AtrDODA(GenBank登錄號：KP165399)和AtrMYB1(GenBank登錄號：KU557504)基因的CDS序列，采用DNAMAN 9.0軟件設(shè)計實時熒光定量PCR引物(表1)，以AtrSAND[18]為內(nèi)參基因，以生長15 d(幼苗期)的不同光周期條件不同莧菜品種的組織部位(葉和莖)及45 d(開花期)的不同組織部位(根、莖、葉和花)為cDNA模板，采用羅氏LightCycler480(Roche，Basel，Switzerland)儀器分別檢測其表達情況。qRT-PCR反應(yīng)采用20 μL體系：Hieff qPCR SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，F(xiàn)orward/Reverse Primer(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板(2 ng)2 μL，ddH2O 7 μL。qRT-PCR程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性 5 min，95 ℃變性 10 s，59 ℃退火 12 s，共重復(fù)40個循環(huán)，3次生物學(xué)重復(fù)。使用2-ΔΔCt計算相對表達量，通過SPSS 24.0計算差異顯著性水平并使用GraphPad prism 6.1作圖。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

圖2 AtrADH2蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(a)、功能位點分析(b)及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測(c)Fig.2 Domain prediction (a), functional site analysis (b), and the tertiary structure prediction (c) of AtrADH2 protein

2 結(jié)果與分析

2.1 莧菜AtrADH2基因克隆

使用引物AtrADH2-ORF-F和AtrADH2-ORF-R對莧菜AtrADH2基因的cDNA序列進行ORF驗證，獲得1條長度約為1 200 bp的條帶(圖1)。經(jīng)測序后表明‘蘇莧1號’和‘蘇莧2號’的ADH2基因序列無差異，ADH2基因開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)長1 197 bp，共編碼398個氨基酸，并將其命名為AtrADH2(GenBank登錄號：MT982371.1)。

M：Marker DL 5 000；A:‘蘇莧1號’AtrADH2-ORF擴增條帶；B: ‘蘇莧2號’AtrADH2-ORF擴增條帶。M: Marker DL 5 000; A: AtrADH2-ORF amplified band of ‘Su Amaranth 1’; B: AtrADH2-ORF amplified band of ‘Su Amaranth 2’.圖1 莧菜AtrADH2基因的ORF擴增Fig.1 ORF amplification of AtrADH2 gene

2.2 莧菜AtrADH2蛋白生物信息學(xué)分析

采用ProParam在線網(wǎng)站分析AtrADH2基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。該蛋白分子式為C1969H3137N559O590S19，相對分子質(zhì)量為44.69 ku，理論等電點為8.36，脂肪系數(shù)為84.47，不穩(wěn)定系數(shù)為35.72，平均疏水性為-0.301；采用NCBI-CDS在線網(wǎng)站分析AtrADH2基因編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，該蛋白有1個特殊位點，為PLN02256，Arogenate dehydrogenase位點，屬于NADB_Rossmann超級家族，具有1個NADB保守結(jié)構(gòu)域(圖2(a))；采用PROSITE預(yù)測該蛋白的功能位點，發(fā)現(xiàn)功能位點PDH_ADH位于序列的中間偏后位置(圖2(b))；采用SPOMA在線網(wǎng)站分析該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該蛋白無規(guī)則卷曲占比最大，為41.46%，α-螺旋次之，為38.44%，延伸鏈為16.08%，β-轉(zhuǎn)角最少，為4.02%；采用SWISS-MODEL在線網(wǎng)站構(gòu)建獲得AtrADH2蛋白的三級結(jié)構(gòu)，AtrADH2蛋白的該模型是以苯甲酸酯脫氫酶1(Prephenate dehydrogenase 1)作為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)建模，兩者序列相似性為51.78%(圖2(c))；采用WoLF PSORT亞細(xì)胞定位顯示，該蛋白主要定位于葉綠體。

2.3 莧菜AtrADH2蛋白序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

通過DNAMAN 9.0軟件將莧菜AtrADH2蛋白序列與藜麥(Chenopodiumquinoa)、碧桃(Prunuspersica)、甜菜(Betavulgaris)、罌粟(Papaversomniferum)、菠菜(Spinaciaoleracea)和番茄(Solanumlycopersicum)的ADH蛋白序列進行多重序列比對分析。結(jié)果顯示：這6種植物均含有NADB_Rossmann 1個保守結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含了1個GXGXXG基序特征(圖3)；NCBI-Blastp結(jié)果表明，由莧菜AtrADH2編碼的氨基酸序列與藜麥、碧桃、甜菜、罌粟、菠菜和番茄ADH蛋白序列的相似度分別為98%、94%、93%、93%、82%和78%；通過MEGA 5.0將莧菜AtrADH2蛋白序列與NCBI登錄的38種植物的ADH蛋白序列進行系統(tǒng)進化樹分析。結(jié)果表明，39種ADH蛋白聚為4個小分支，莧菜AtrADH2蛋白與含甜菜色素植物的甜菜、藜麥及菠菜的ADH蛋白聚為1個分支且與甜菜BvADHα親緣關(guān)系最近(圖4)。

綠框表示GXGXXG基序；紅框表示β1e-β1f環(huán)路殘基。相似性：黑色=100%；深灰色≥75%；灰色≥50%。The green box represents the GXGXXG motif, and the red box represents β1e-β1f loop residues.Similarity: black=100%; dark gray ≥75%; gray ≥50%.圖3 AtrADH2與其他物種ADH氨基酸序列多重序列比對Fig.3 Multiple alignment of AtrADH2 with other species ADH amino acid sequences

分支上的數(shù)值表示1 000次重復(fù)抽樣符合聚類的百分?jǐn)?shù)。The number on the branch represents the percentage of 1000 repeated samples in accordance with the clustering.圖4 AtrADH2與其他物種ADH蛋白序列系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of AtrADH2 and other species ADH protein sequences

2.4 不同光周期條件對莧菜幼苗生長的影響

在不同光周期條件下生長15 d后通過表型觀察發(fā)現(xiàn)，‘蘇莧1號’除根部外全株呈現(xiàn)紅色，‘蘇莧2號’除根部外全株呈現(xiàn)淺綠色；‘蘇莧1號’‘蘇莧2號’在相同光周期條件下生長趨勢基本一致，在8 h/16 h光周期條件下莧菜植株莖細(xì)小，葉片數(shù)少于其它光周期條件(圖5(a)和(b))。

從左至右光周期條件為：8 h/16 h、12 h/12 h、16 h/8 h和20 h/4 h。The conditions of the photoperiod from left to right is 8 h/16 h, 12 h/12 h, 16 h/8 h and 20 h/4 h, respectively.圖5 不同光周期條件下生長15天后莧菜幼苗的形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.5 Morphological structure in different photoperiod conditions grown 15 days of amaranth seedlings

2.5 不同光周期條件及組織部位對莧菜甜菜色素含量的影響

不同光周期條件下其甜菜色素含量變化有所差異。在不同光周期條件下生長15 d后，‘蘇莧1號’葉中的甜菜色素含量在12 h/12 h光周期下有所下降，而莖中的甜菜色素含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(圖6(a)和(b))；不同組織部位其甜菜色素含量也有所差異，根中的甜菜色素含量最低，莖與花之間的甜菜色素含量無明顯差異，葉中的甜菜色素含量最高(圖6(c))。

不同大寫字母表示P<0.01水平差異極顯著，不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。下同。Different uppercase letters indicate extremely significant difference level at P<0.01, and different lowercase letters indicate significant difference level at P<0.05. The same below.圖6 不同光周期條件及組織部位‘蘇莧1號’甜菜色素含量Fig.6 Betalain content in different photoperiod conditions and tissues of ‘Su Amaranth 1’

2.6 AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在不同光周期條件下的表達影響

采用qRT-PCR技術(shù)分析莧菜AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在莧菜不同光周期條件下的表達情況。結(jié)果表明，AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因在‘蘇莧1號’葉中8 h/16 h光周期條件下其相對表達量最高，16 h/8 h光周期條件下其相對表達量最低；在‘蘇莧1號’莖中AtrCYP76AD1和AtrMYB1基因其表達趨勢基本一致，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，AtrDODA基因在‘蘇莧1號’莖中其相對表達量趨勢與其葉基本一致；AtrADH2基因在‘蘇莧1號’葉中12 h/12 h光周期條件下其相對表達量最高，16 h/8 h光周期條件下其相對表達量最低；莖中16 h/8 h光周期條件下其相對表達量最低(圖7(a)、(b)、(c)和(d))。

圖7 AtrCYP76AD1(a)、AtrDODA(b)、AtrMYB1(c)和AtrADH2(d)基因在‘蘇莧1號’不同光周期條件下的相對表達量Fig.7 Relative expression level of AtrCYP76AD1(a), AtrDODA(b), AtrMYB1(c) and AtrADH2(d) genes in different photoperiod conditions of ‘Su Amaranth 1’

AtrCYP76AD1基因在‘蘇莧2號’葉中12 h/12 h光周期條件下其相對表達量最高，莖中呈現(xiàn)下降趨勢(圖8(a))；AtrDODA基因在‘蘇莧2號’葉中8 h/16 h光周期條件下其相對表達量最高，莖中16 h/8 h光周期條件下其相對表達量最低(圖8(b))；AtrMYB1基因在‘蘇莧2號’葉中8 h/16 h光周期條件下其相對表達量最低，莖中20 h/4 h光周期條件下其相對表達量最低(圖8(c))；AtrADH2基因在‘蘇莧2號’葉和莖中12 h/12 h光周期條件下其相對表達量均最高(圖8(d))。

圖8 AtrCYP76AD1(a)、AtrDODA(b)、AtrMYB1(c)和AtrADH2(d)基因在‘蘇莧2號’不同光周期條件下的相對表達量Fig.8 Relative expression level of AtrCYP76AD1(a), AtrDODA(b), AtrMYB1(c) and AtrADH2(d) genes in different photoperiod conditions of‘Su Amaranth 2’

2.7 AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在不同莧菜品種的表達影響

采用qRT-PCR技術(shù)分析莧菜AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在不同莧菜品種的表達情況。結(jié)果表明，AtrCYP76AD1和AtrDODA基因在‘蘇莧1號’葉和莖的相對表達量均顯著高于‘蘇莧2號’葉和莖的相對表達量(圖9(a)和(b))；AtrMYB1基因在‘蘇莧1號’葉的相對表達量顯著高于‘蘇莧2號’葉的相對表達量，在‘蘇莧1號’莖的相對表達量顯著低于‘蘇莧2號’莖的相對表達量(圖9(c))；AtrADH2基因在‘蘇莧1號’葉和莖的相對表達量均顯著低于‘蘇莧2號’葉和莖的相對表達量，推測AtrADH2基因可能對甜菜色素合成有負(fù)調(diào)控作用(圖9(d))。

*表示P<0.05水平差異顯著。下同。* indicate P<0.05 significant difference level. The same below.圖9 AtrCYP76AD1(a)、AtrDODA(b)、AtrMYB1(c)和AtrADH2(d)基因在不同莧菜品種的相對表達量Fig.9 Relative expression level of AtrCYP76AD1(a), AtrDODA(b), AtrMYB1(c) and AtrADH2(d) genes in different amaranth varieties

2.8 AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在不同組織部位的表達影響

采用qRT-PCR技術(shù)分析AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在‘蘇莧1號’莧菜不同組織部位(根、莖、葉和花)的表達情況。結(jié)果表明，AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因在莖中的相對表達量最高(圖10(a)、(b)和(c))，AtrADH2基因在不同的組織部位存在差異性，在根中的相對表達量最高，莖中的相對表達量最低，推測AtrADH2基因可能對甜菜色素合成有負(fù)調(diào)控作用(圖10(d))。

圖10 AtrCYP76AD1(a)、AtrDODA(b)、AtrMYB1(c)和AtrADH2(d)基因在‘蘇莧1號’不同組織部位的相對表達量Fig.10 Relative expression level of AtrCYP76AD1(a), AtrDODA(b), AtrMYB1(c) and AtrADH2(d) genes in different tissues of ‘Su Amaranth 1’

2.9 AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在不同時期的表達影響

采用qRT-PCR技術(shù)分析AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因在‘蘇莧1號’莧菜不同生長時期葉和莖的表達情況。結(jié)果表明，與幼苗期相比，AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因葉中的相對表達量在開花期顯著下降，而莖中的相對表達量顯著提高(圖11(a)、(b)和(c))；AtrADH2基因葉中的相對表達量在開花期顯著提高，而莖中的相對表達量無明顯差異(圖11(d))。

圖11 AtrCYP76AD1(a)、AtrDODA(b)、AtrMYB1(c)和AtrADH2(d)基因在‘蘇莧1號’不同時期的相對表達量Fig.11 Relative expression level of AtrCYP76AD1(a), AtrDODA(b), AtrMYB1(c) and AtrADH2(d) genes in different period of ‘Su Amaranth 1’

3 討論與結(jié)論

3.1 莧菜AtrADH2基因分析

酪氨酸是所有生物體蛋白質(zhì)合成所必需的芳香族氨基酸，是甜菜色素等次生代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)[7,19]，本研究通過RT-PCR技術(shù)首次在莧菜中獲得了ADH2基因的ORF序列，并提交于NCBI-GenBank將其命名為AtrADH2，基因登錄號為MT982371.1。生物信息學(xué)分析表明，AtrADH2蛋白屬于NADB_Rossmann超級家族，具有1個NADB保守結(jié)構(gòu)域，包含了1個GXGXXG基序特征，該家族中的蛋白質(zhì)還包含第2個結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)特異性結(jié)合底物并催化特定的酶促反應(yīng)，Schenck等[20]表示該保守結(jié)構(gòu)域中β1e-β1f環(huán)路上的殘基有助于特異性底物催化反應(yīng)的正確定位。該蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體；通過同源性比較發(fā)現(xiàn)，AtrADH2與BvADHα親緣關(guān)系最近，并與石竹目植物菠菜、藜麥的ADH蛋白序列聚為1個分支，表明AtrADH2在生物進化過程中是相對保守的。

3.2 不同光周期對莧菜AtrADH2基因表達的影響

光周期可以影響植物營養(yǎng)生長發(fā)育、植物體內(nèi)一些次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生和植物化學(xué)物質(zhì)的積累[14-15]。有研究表明，對三角梅進行遮光處理后，其甜菜紅素的含量和4,5-DOPA基因的表達量均表現(xiàn)出下降趨勢[21]，莧菜老葉中的甜菜色素含量比新葉低[22]。本次研究發(fā)現(xiàn)，其甜菜紅素和甜菜黃素的含量在12 h/12 h光周期條件有下降趨勢，推測可能與出現(xiàn)的葉片數(shù)和光照日長有關(guān)。此外，DODA基因[23]和細(xì)胞色素P450酶基因[24-25]是甜菜色素代謝過程中的關(guān)鍵基因，有研究表明，AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因的表達受到光質(zhì)[26]、溫度[27]和赤霉素[28]等環(huán)境因素和生長調(diào)節(jié)劑的影響，與甜菜色素含量變化趨勢相同。本研究發(fā)現(xiàn)，AtrCYP76AD1、AtrDODA、AtrMYB1和AtrADH2基因的相對表達量均受到了光周期的影響。

3.3 不同品種、時期及組織部位對莧菜AtrADH2基因表達的影響

BvADHα基因在甜菜中的表達具有組織特異性。有研究表明，BvADHα基因在紅甜菜和甜菜品種子葉和下胚軸中均有表達，且紅甜菜子葉表達最高[13]，BvADHα基因的表達模式與甜菜色素合成基因(BvCYP76AD1α和BvDODAα)、BvMYB1轉(zhuǎn)錄因子具有相似性，對甜菜色素合成具有正向調(diào)控作用[13]。Ohno等[29]研究發(fā)現(xiàn)，BpADH基因在白色三角梅和紅色三角梅中均有表達，且白色三角梅表達較高，BpADH基因與甜菜色素合成相關(guān)基因BpCYP76AD1和BpDODA1基因的表達模式趨勢相反。Oliveira等[12]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中酪氨酸的積累對ADH酶活性具有反饋抑制作用。本研究通過qRT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，AtrADH2基因在不同莧菜品種中其表達具有差異性，AtrADH2基因在‘蘇莧1號’葉和莖的相對表達量均低于‘蘇莧2號’葉和莖的相對表達量；AtrADH2基因在‘蘇莧1號’莧菜品種不同組織部位中的表達也具有組織特異性，AtrADH2基因在‘蘇莧1號’莧菜品種的根、莖、葉和花中均有表達，且在根中的表達量最高，莖中的表達量最低，表明AtrADH2基因可能對莧菜中甜菜色素的合成有負(fù)調(diào)控作用。此外，對不同生長時期的葉和莖中基因的表達情況進行分析發(fā)現(xiàn)，AtrCYP76AD1、AtrDODA和AtrMYB1基因在開花期葉中其相對表達量顯著下降，莖中其相對表達量顯著提高，與甜菜色素含量趨勢相同，而AtrADH2基因在開花期葉中其相對表達量顯著上升，莖中其相對表達量無明顯差異，與甜菜色素含量趨勢相反，進一步說明AtrADH2基因可能對甜菜色素合成具有負(fù)調(diào)控作用。

綜上所述，光周期是影響莧菜生長及甜菜色素產(chǎn)生的重要環(huán)境因子，影響甜菜色素生物合成過程中相關(guān)基因的表達，AtrADH2基因可能是調(diào)控莧菜甜菜色素合成的重要基因，其表達存在組織特異性，可能對莧菜甜菜色素的合成起負(fù)調(diào)控作用，其反饋抑制作用及功能有待進一步研究。