谷子秸稈雨水淋溶物對(duì)其根圍土壤細(xì)菌多樣性的化感效應(yīng)

馮茹姬 胡春艷 董淑琦 楊雪芳 郭振宇 原向陽(yáng) 胡桃花 郭平毅

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801；3.山西省晉中市氣象局，山西 晉中 030600)

化感作用指活體植物、微生物向環(huán)境中釋放的某種化學(xué)物質(zhì)，對(duì)其他生物或自身生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的直接或間接的促進(jìn)或者抑制作用[1]。化感效應(yīng)存在于許多根系分泌物和植物殘?bào)w腐解物中[2]。雨霧淋溶、自然揮發(fā)、根分泌和植株分解是植物化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中的4種途徑。從植株殘?bào)w中得到的降水淋溶液可以顯著抑制其他植物生長(zhǎng)[3-4]，利用植物殘?bào)w覆蓋耕地能夠有效地控制雜草[5]，都說(shuō)明植株殘?bào)w淋溶是化感物質(zhì)釋放的途徑之一。

土壤微生物能反映土壤肥力和質(zhì)量變化以及環(huán)境質(zhì)量狀況，其種群數(shù)量關(guān)系到有機(jī)質(zhì)的分解和礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化，影響作物的吸收和利用[6]。秸稈還田是秸稈綜合利用最有效和最主要的途徑，還田方式分為直接還田和間接還田[7]。不同秸稈還田方式對(duì)土壤理化性狀的影響效果不同，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生的影響不同：一方面秸稈還田通過(guò)影響土壤結(jié)構(gòu)、土壤微氣候(土壤水分、土壤溫度等)和土壤養(yǎng)分，可顯著影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性[8-12]；另一方面秸稈還田為微生物提供豐富的能量和碳源，提高微生物的生物活性，為促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和礦質(zhì)元素的轉(zhuǎn)化提供有力保障，如此往復(fù)形成良性的循環(huán)鏈，進(jìn)而對(duì)后期作物健康生長(zhǎng)及豐產(chǎn)有著積極的推動(dòng)作用[13-17]。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田配施混合控釋氮肥增加了參與纖維素和木質(zhì)素降解的假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和腐質(zhì)霉屬等細(xì)菌的豐度，加速了小麥灌漿期土壤的礦化和腐殖化過(guò)程，在實(shí)現(xiàn)作物增產(chǎn)的同時(shí)循環(huán)利用作物秸稈。張翰林等[19]研究發(fā)現(xiàn)秸稈還田處理提升了稻麥輪作土壤真菌群落多樣性，但對(duì)細(xì)菌群落多樣性無(wú)顯著影響。韋安培[20]研究表明，秸稈還田顯著改善了土壤理化性質(zhì)，顯著提高土壤微生物碳源代謝能力和代謝活性，最終顯著增加了小麥產(chǎn)量。另外，周東興等[21]研究發(fā)現(xiàn)，隨著秸稈還田量的增加，秸稈腐解微生物群落碳源代謝活性、豐富度指數(shù)、優(yōu)勢(shì)度指數(shù)和均勻度指數(shù)均表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。但是李濤等[22]的研究表明秸稈施入雖然提高了土壤微生物群落的生理代謝活性，但對(duì)微生物功能多樣性指數(shù)沒(méi)有顯著性影響。近年來(lái)，對(duì)秸稈還田條件下土壤微生物進(jìn)行的一些相關(guān)研究，主要集中在水稻、小麥和玉米等作物上[23-27]，對(duì)谷子的研究相對(duì)較少。因此，為了解秸稈覆蓋化感物質(zhì)對(duì)根圍土壤細(xì)菌群落多樣性的影響，本研究擬采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，在谷子株高達(dá)到20 cm后于壟間覆蓋不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈，灌漿期中雨后5 d采集根圍土壤，利用16S rRNA擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析谷子秸稈雨水淋溶物對(duì)其根圍土壤的細(xì)菌種群豐度和多樣性的化感效應(yīng)，以期為合理的秸稈覆蓋還田技術(shù)推廣應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站(37°25′ N，112°34′ E)，海拔799.6 m。屬于暖溫帶大陸性氣候，年均日照時(shí)間為2 500～2 600 h，一年的有效積溫約3 500～3 600 ℃，平均年降水量462.90 mm，每年的降水主要集中在7、8和9月。試驗(yàn)土壤類(lèi)型為沙壤土，播前表層土壤各養(yǎng)分含量為：有機(jī)質(zhì)8.52 g/kg，全氮1.22 g/kg，全磷0.76 g/kg，全鉀19.36 g/kg，硝態(tài)氮64.20 mg/kg，有效磷43.70 mg/kg，速效鉀484.20 mg/kg，pH 8.21。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2019年5月—10月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田進(jìn)行。試驗(yàn)品種為晉谷21號(hào)(山西省農(nóng)科院經(jīng)濟(jì)作物研究所選育)，于2019年5月播種，播前撒施復(fù)合肥750 kg/hm2作為基肥，谷子生長(zhǎng)期間不施肥，進(jìn)行常規(guī)田間管理。在谷子出苗20 cm時(shí)，將供試秸稈均勻覆蓋在對(duì)應(yīng)區(qū)域行間。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)不同秸稈質(zhì)量和不同秸稈長(zhǎng)度2個(gè)因素，以不覆蓋秸稈為對(duì)照，共7個(gè)處理組合，每處理重復(fù)3次，每小區(qū)面積為20 m2(4 m×5 m)。試驗(yàn)區(qū)組設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)地秸稈覆蓋方案Table 1 Straw mulching scheme of experimental

土樣采集：于2019年谷子灌漿期中雨后5 d采用五點(diǎn)取樣法采集0～5 cm谷子根圍表層土壤，每小區(qū)重復(fù)3次，去除谷子根系、植株殘?bào)w和石子等雜物，過(guò)1 mm土壤分樣篩后混合均勻，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，保存至-80 ℃冰箱用于DNA提取等分子生物學(xué)分析。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1DNA 抽提

土壤總DNA抽提使用E.Z.N.A.?soil試劑盒，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2 000進(jìn)行檢測(cè)，DNA提取質(zhì)量利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電壓5 V/cm，時(shí)間20 min。

1.3.2PCR擴(kuò)增

用特異性引物515F (5′-GTGYCAGCMGCC-GCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGG-TWTCTAAT-3′)對(duì)細(xì)菌16S V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，35個(gè)循環(huán)(95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL。

1.3.3PCR產(chǎn)物鑒定、純化及定量

每個(gè)樣本3個(gè)PCR重復(fù)，將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，Tris-HCl洗脫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，再采用QuantusTMFluorometer對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)定量。按照測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合后進(jìn)行細(xì)菌多樣性測(cè)定。

1.3.4高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[28]、[29]和[30]的方法將測(cè)序序列結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控后得到有效數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件、SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行OTUs聚類(lèi)和物種注釋分析。以樣本中數(shù)據(jù)量最少的為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，進(jìn)行Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析。

使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數(shù)；使用Origin 2021繪制稀釋曲線；使用R軟件(Version 2.15.3)通過(guò)wilcox秩和檢驗(yàn)分析Alpha多樣性指數(shù)差異性；使用R軟件的vegan軟件包進(jìn)行NMDS分析。

利用PICRUSt將細(xì)菌OTU豐度矩陣與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得菌群功能預(yù)測(cè)信息，用R軟件繪制聚類(lèi)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌物種聚類(lèi)分析

2.1.1不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌物種聚類(lèi)最小操作單元(OTU)分析

將不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下的谷子根圍土壤細(xì)菌的測(cè)序有效數(shù)據(jù)聚類(lèi)，共得到9 480個(gè)OTUs。OTUs序列的注釋結(jié)果中，能夠注釋到界水平的OTUs數(shù)目為8 212(占86.62%)，其中：門(mén)水平占74.56%；綱水平占66.18%；目水平占56.57%；科水平占46.37%；屬水平占26.10%;僅有506個(gè)OTU注釋到種水平。

土壤細(xì)菌物種花瓣圖見(jiàn)圖1?？芍?個(gè)處理共有的OTU數(shù)目為2 576，其中W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1、W3L3、CK特有的OTU數(shù)目分別為326、338、335、504、283、189及149，W2L3處理下較其他處理下的特異性細(xì)菌OTU數(shù)目最多。

花瓣圖中每個(gè)花瓣代表一個(gè)處理，不同的顏色代表不同的處理。中間的Core數(shù)字代表的是所有處理共有的OTU數(shù)目，花瓣上的數(shù)字代表該處理特有的OTU數(shù)目。In the petal diagram, each petal represents one treatment, and different colors represent different treatments. The core number in the middle represents the number of OTUs common to all treatments, and the number on the petal represents the number of OTUs unique to this treatment.圖1 土壤細(xì)菌物種花瓣圖Fig.1 Petal diagram of soil bacterial species

2.1.2不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌群落組成分析

細(xì)菌門(mén)水平物種相對(duì)豐度的結(jié)果見(jiàn)圖2。可知：相對(duì)豐度>1%的門(mén)類(lèi)共有5門(mén)，分別是：變形桿菌門(mén)(Proteobacteria，占28.46%～36.36%)；酸桿菌門(mén)(Acidobacteria，占13.35%～18.48%)；放線桿菌門(mén)(Actinobacteria，占12.14%～14.01%)；芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes，占10.67%～13.98%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，占7.81%～10.60%)。所有處理下土壤細(xì)菌在門(mén)水平物種組成的優(yōu)勢(shì)門(mén)相同，均為變形桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)，但其相對(duì)豐度有差異(圖2)。雨水淋溶不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈，土壤細(xì)菌酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度與CK相比均有不同程度的增加，增加幅度為1.12%～6.25%；土壤芽單胞菌門(mén)相對(duì)豐度與CK相比均有不同程度的減少，減少范圍為0.70%～3.10%，W2L3處理下變形桿菌門(mén)相對(duì)豐度比CK降低6.13%，放線桿菌門(mén)相對(duì)豐度比CK降低4.89%。

圖2 土壤細(xì)菌門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度圖Fig.2 Relative abundance of soil bacterial community based on Phylum level

由細(xì)菌屬水平物種相對(duì)豐度的結(jié)果可知：相對(duì)豐度>1%的屬共有9屬，分別是：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，占4.65%～7.63%)；目前綱科目未定的酸桿菌門(mén)(unidentified Acidobacteria，占2.66%～4.16%)；斯克爾曼氏菌屬(Skermanella，占1.21%～1.63%)；乳桿菌屬(Lactobacillus，占1.06%～2.58%)；黃色土源菌屬(Flavisolibacter，占1.00%～1.95%)；芽單胞菌屬(Gemmatimonas，占1.00%～1.68%)；馬賽菌屬(Massilia，占0.25%～1.11%)；Ramlibacter(占0.40%～1.03%)和溶桿菌屬(Lysobacter，占0.49%～1.06%)。各處理下土壤細(xì)菌在屬水平物種組成的優(yōu)勢(shì)屬略有不同，為鞘氨醇單胞菌屬、目前綱科目未定的酸桿菌門(mén)、乳桿菌屬、黃色土源菌屬、芽單胞菌屬、斯克爾曼氏菌屬中的4～6屬，且優(yōu)勢(shì)屬的相對(duì)豐度有較大差異，其中馬賽菌屬和Ramlibacter是CK處理下特有優(yōu)勢(shì)屬，溶桿菌屬是W1L3處理下特有優(yōu)勢(shì)屬。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3處理較CK處理鞘氨醇單胞菌屬相對(duì)豐度在5%顯著水平下均顯著下降，分別下降23.98%、39.06%、25.69%、32.24%、18.22%和20.58%；W1L3、W2L1、W3L1和W3L3處理下黃色土源菌屬相對(duì)豐度在5%顯著水平下較CK處理顯著下降71.90%、30.16%、47.62%和59.79%；W1L3、W2L3和W3L3處理下芽單胞菌屬相對(duì)豐度在5%顯著水平下較CK處理顯著下降45.24%、40.48%和10.71%。

2.2 不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌Alpha多樣性分析

2.2.1不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌稀釋曲線分析

不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌稀釋曲線見(jiàn)圖3。結(jié)果所示：不同質(zhì)量和不同長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下土壤細(xì)菌稀釋曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，更多的數(shù)據(jù)量只會(huì)產(chǎn)生少量新的物種(OTUs)，基本可以反映出不同秸稈覆蓋處理下谷子根圍土壤細(xì)菌變化趨勢(shì)。隨測(cè)序數(shù)量的增加，物種數(shù)量先是急劇增加，后變得漸進(jìn)平緩，說(shuō)明各秸稈覆蓋處理下新的物種增加量已經(jīng)很少，數(shù)據(jù)分析時(shí)均一化選取量(Cutoff=39 641)合理。測(cè)序條數(shù)在6 615以下時(shí)曲線急劇上升，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線基本重合，隨測(cè)序條數(shù)不斷增加，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線逐漸分離，其物種量的豐富程度出現(xiàn)差異，在測(cè)序條數(shù)達(dá)到26 430后，各秸稈覆蓋處理的稀釋曲線完全分離。6種秸稈覆蓋處理下，根圍土壤細(xì)菌物種量的豐富程度差異不明顯，W2L1秸稈覆蓋處理下土壤細(xì)菌物種量的豐富程度最高，對(duì)照(不覆蓋秸稈)處理下土壤細(xì)菌物種量的豐富程度最低，不同秸稈覆蓋處理下土壤細(xì)菌物種量的豐富程度由高到低的排列順序?yàn)椋篧2L1>W1L3>W2L3>W3L1>W1L1>W3L3>CK。

注：稀釋曲線中，橫坐標(biāo)為從某個(gè)處理中隨機(jī)抽取的測(cè)序條數(shù)，縱坐標(biāo)為基于該測(cè)序條數(shù)能構(gòu)建的OTU數(shù)量，用來(lái)反映測(cè)序深度情況，不同的樣本使用不同顏色的曲線表示。Note：In the dilution curve, the horizontal coordinate is the number of sequencing numbers randomly selected from one treatment, and the vertical coordinate is the number of OTUs that can be constructed based on the number of sequencing numbers to reflect the sequencing depth. Different treatments are represented by curves in different colors.圖3 土壤細(xì)菌OTU稀釋曲線Fig.3 Dilution curve of soil bacteria

2.2.2不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)分析

不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)組間差異箱型圖見(jiàn)圖4。由Alpha 多樣性指數(shù)分析可知：不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋后谷子根圍表層土壤細(xì)菌Alpha多樣性指數(shù)均>CK，說(shuō)明秸稈覆蓋提高了谷子根圍土壤細(xì)菌群落豐富度及多樣性。反映群落豐富度的理論預(yù)估值(Chao1指數(shù)和ACE指數(shù))在不同程度的受到秸稈雨水淋溶物質(zhì)的影響，所有處理下ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)的變化趨勢(shì)一致，但差異并不顯著，說(shuō)明秸稈覆蓋下谷子根圍土壤細(xì)菌豐富度均有提高，且土壤細(xì)菌豐富度與秸稈覆蓋量呈現(xiàn)正相性關(guān)系(圖4)。結(jié)合土壤細(xì)菌屬水平上的物種相對(duì)豐度數(shù)據(jù)可知，各處理在屬水平群落均勻度增加，表現(xiàn)為相對(duì)豐度占比較高的綱科目未定的酸桿菌屬、斯克爾曼氏菌屬、乳桿菌屬與CK相比豐度增加，而鞘氨醇單胞菌屬、黃色土源菌屬、芽單胞菌屬與CK相比豐度減少。Shannon指數(shù)的各處理離散程度與CK相比均較小(圖4)。在1 cm長(zhǎng)度(L1)的谷子秸稈覆蓋下，反映群落物種多樣性的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)隨覆蓋質(zhì)量的增加而增加，但是在5 cm 長(zhǎng)度(L3)的秸稈覆蓋下，隨覆蓋質(zhì)量的增加Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)先增加后減小。各處理的Shannon指數(shù)均>CK，但只有W1L3和W3L1處理與CK相比達(dá)到了差異顯著或極顯著水平；各處理間均未達(dá)到差異水平。W1L1、W1L3、W2L1、W2L3、W3L1和W3L3的Simpson指數(shù)與CK相比均增加，但只有W1L3和W3L3處理與CK相比達(dá)到了差異顯著或極顯著水平；W2L3處理與W1L3、W3L3處理分別差異顯著或極顯著(圖4)。

圖4 Alpha多樣性指數(shù)組間差異箱型圖Fig.4 Box graph of Alpha diversity index between different group

2.3 不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌Beta多樣性分析

經(jīng)NMDS分析可知：不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下土壤細(xì)菌群落N(xiāo)MDS分析的應(yīng)力值為0.102，擬合水平較理想，可以準(zhǔn)確反映不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下土壤細(xì)菌群落間的差異程度。不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下的土壤樣本大體聚類(lèi)為3組：W1L3、W2L3、W3L3 3種秸稈覆蓋量處理聚類(lèi)在一起；W1L1、W2L1、W3L1 3種秸稈覆蓋量處理聚類(lèi)在一起；CK單獨(dú)聚類(lèi)，反映了不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈雨水淋溶物對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯的影響。從圖中各處理樣品點(diǎn)的相對(duì)位置可以看出W1L3、W2L3、W3L3的細(xì)菌物種組成更為相似且均距離CK較遠(yuǎn)，說(shuō)明不同秸稈長(zhǎng)度和質(zhì)量覆蓋還田后，W1L3、W2L3、W3L3處理與其他處理已明顯分開(kāi)，細(xì)菌物種組成已出現(xiàn)差異；但其他處理仍有交叉，細(xì)菌物種組成差異不明顯。

2.4 不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌群落PICRUSt功能預(yù)測(cè)

2.4.1功能基因家族組成

將預(yù)測(cè)得到的功能基因家族與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，第一等級(jí)上，所有菌群的基因序列注釋到的功能可分為6類(lèi)，其中前3類(lèi)分別是：新陳代謝、遺傳信息加工和環(huán)境信息加工。第二等級(jí)上，參與新陳代謝的菌群中，以參與碳水化物代謝、氨基酸代謝和能量代謝的為最大類(lèi)群；參與遺傳信息加工的菌群中，參與翻譯類(lèi)群具有明顯優(yōu)勢(shì)，其次是復(fù)制和修復(fù)的類(lèi)群；參與環(huán)境信息加工的菌群中，參與膜轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的類(lèi)群具有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.4.2代謝相關(guān)基因分析

對(duì)不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的秸稈覆蓋下的土壤樣品的KEGG直系同源基因簇(KEGG orthologous groups)豐度熱圖(圖5)分析發(fā)現(xiàn)，碳水化物代謝、氨基酸代謝和能量代謝通路上的相關(guān)基因表達(dá)差異較為顯著；各土壤樣品可大致聚為W3L1、W3L3、CK和W1L1、W1L3、W2L1、W2L3 2類(lèi)，秸稈化感物質(zhì)明顯降低代謝相關(guān)基因豐度，其中W2L1秸稈覆蓋處理下代謝相關(guān)基因豐度與其他6個(gè)處理具有明顯劣勢(shì)。對(duì)該處理下劣勢(shì)基因所對(duì)應(yīng)的酶進(jìn)行篩選并歸類(lèi)，得到：與脂肪酸合成代謝相關(guān)的?；d體蛋白還原酶(K00059)，與能源物質(zhì)代謝相關(guān)的重要中間代謝物乙酰CoA(K00626)，具有特異催化蛋白質(zhì)底物功能(絲氨酸、蘇氨酸羥基磷酸化)的蛋白激酶(K08884)，作用于支鏈氨基酸(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的酶(K01955、K00265、K01915)，參與肽/鎳轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)底物結(jié)合和滲透的酶蛋白(K02035)，參與蛋白質(zhì)及氨基酸代謝相關(guān)蛋白(K00548)。

KEGG直系同源基因簇(KO)豐度熱圖中，橫坐標(biāo)表示所測(cè)土壤樣本,縱坐標(biāo)表示代謝相關(guān)基因所對(duì)應(yīng)的酶。In the abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster, the horizontal coordinate represents the soil samples tested, and the vertical coordinate represents enzymes corresponding to metabolism-related genes.圖5 不同土壤樣本細(xì)菌群落KEGG直系同源基因簇(KO)豐度熱圖Fig.5 Abundance heatmap of KEGG orthologous groups (KO) cluster for different soil samples bacterial community

3 討 論

3.1 秸稈化感物質(zhì)對(duì)谷子根圍表層土壤細(xì)菌群落組成及多樣性的影響

作為農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，土壤微生物在土壤有機(jī)質(zhì)形成和轉(zhuǎn)化、土壤養(yǎng)分循環(huán)等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[31]。同時(shí)，土壤微生物群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和其生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵性指標(biāo)之一[32]。秸稈中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可在還田后為土壤微生物提供豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，提高群落多樣性和豐富度以及土壤微生物代謝能力[33]。沈曉琳等[34]的研究表明，秸稈還田提高了土壤團(tuán)聚體細(xì)菌和真菌生物量，改善了土壤團(tuán)聚體微生物群落結(jié)構(gòu)，增加了土壤固碳能力和保持土壤微生物多樣性。本研究中各樣品中細(xì)菌群落共有的OTUs種類(lèi)占自身比例較小，特有的OTUs種類(lèi)較多。物種注釋結(jié)果表明：所有處理下土壤細(xì)菌在門(mén)水平物種組成的優(yōu)勢(shì)門(mén)相同，均為變形桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線桿菌門(mén)和芽單胞菌門(mén)，但相對(duì)豐度有差異。雨水淋溶不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈，增加了土壤細(xì)菌酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度，減少了土壤芽單胞菌門(mén)的相對(duì)豐度。不同秸稈覆蓋處理下，谷子根圍土壤細(xì)菌群落內(nèi)的豐富度分析中，土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)的分析表明秸稈覆蓋處理為W1L3和W2L3時(shí)能讓細(xì)菌的豐富度維持在較高水平。秸稈還田不僅為土壤提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，供給植物和微生物生長(zhǎng)，同時(shí)秸稈在雨水淋溶之后化感物質(zhì)滲入地表，低濃度的化感物質(zhì)能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，高濃度的化感物質(zhì)抑制微生物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，導(dǎo)致微生物群落豐富度下降。從土壤細(xì)菌群落間多樣性分析來(lái)看，相比無(wú)秸稈覆蓋處理下，在秸稈覆蓋量為W1L3及W2L1處理下細(xì)菌群落多樣性較高，土壤細(xì)菌多樣性明顯提高，秸稈覆蓋量小，雨水淋溶化感物質(zhì)少，促進(jìn)了土壤細(xì)菌多樣性。不同質(zhì)量和長(zhǎng)度的谷子秸稈覆蓋下其根圍土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)圖和NMDS分析都表明W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理時(shí)土壤細(xì)菌群落組成優(yōu)勢(shì)屬差異較大，但其群落結(jié)構(gòu)較其他秸稈覆蓋處理更加穩(wěn)定。因此，W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理更有利于提高細(xì)菌群落的多樣性和維持細(xì)菌群落的均勻度和穩(wěn)定性。綜合群落內(nèi)和群落間的分析，當(dāng)秸稈覆蓋量為W1L3和W3L1秸稈覆蓋處理時(shí)，秸稈雨水淋溶物化感作用促進(jìn)土壤細(xì)菌群落豐富度較高，細(xì)菌的多樣性較高和均勻度較好且群落比較穩(wěn)定。

3.2 功能預(yù)測(cè)

KEGG豐度熱圖的初步分析發(fā)現(xiàn)W2L1秸稈覆蓋處理的多種與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝的酶基因相對(duì)豐度具有明顯劣勢(shì)。酰基載體蛋白還原酶能從頭合成脂肪酸[35]。乙酰CoA是代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，與許多代謝途徑和轉(zhuǎn)化相互交叉[36]。這些功能酶在土壤細(xì)菌中存在，使得土壤中碳水化合物的代謝和脂類(lèi)代謝得到促進(jìn)。本研究中上述酶基因豐度較不覆蓋秸稈處理明顯減少，表明在W2L1處理產(chǎn)生的秸稈淋溶物減少了土壤中與碳代謝有關(guān)的細(xì)菌類(lèi)群，抑制了碳源利用能力。氨基酸作為土壤微生物的優(yōu)良碳源和氮源[37]，能促進(jìn)土壤微生物活動(dòng)，增加土壤微生物數(shù)量[38]。氨基酸的合成是碳代謝與氮代謝的樞紐[39]。本研究表明，W2L1處理產(chǎn)生的秸稈淋溶物減少了土壤中與碳代謝及氮代謝相關(guān)細(xì)菌，抑制土壤碳、氮代謝。此外，鎳元素能促進(jìn)氮素轉(zhuǎn)運(yùn)，參與尿素的水解過(guò)程，缺乏鎳元素會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)尿素的積累[40-42]，鈦元素可以增加葉綠素含量、提高光合效率，增強(qiáng)植物細(xì)胞活力[39]。本研究表明，W2L1處理產(chǎn)生的秸稈淋溶物與CK相比降低了鈦、鎳元素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的酶基因豐度，抑制了土壤中微量元素鈦和有益元素鎳的利用。

4 結(jié) 論

谷子秸稈的雨水淋溶物可以改善土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，提高其群落多樣性，尤以W1L3(2 000 kg/hm2秸稈覆蓋量、鍘切長(zhǎng)度5 cm)處理產(chǎn)生的雨水淋溶物化感促進(jìn)效果較好，且W3L1(4 000 kg/hm2秸稈覆蓋量、鍘切長(zhǎng)度1 cm)處理產(chǎn)生的秸稈淋溶物對(duì)碳水化合物代謝、氨基酸代謝和能量代謝通路上的相關(guān)基因表達(dá)的化感抑制效果較為顯著。