黃芩乙醇提取物對獼猴桃潰瘍病致病菌抑菌機理研究

裴滬榮　盧明秀　龍力　龍章富

摘要：【目的】探究黃芩乙醇提取物（Ethanol extract of Scutellaria baicalensis，ESB）對獼猴桃潰瘍病病原菌丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae， Psa）的抑菌機理，為開發(fā)新型植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。【方法】以Psa為研究對象，采用瓊脂打孔法評估Psa對ESB的敏感性;通過梯度稀釋法確定液體培養(yǎng)時ESB對Psa的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。探究1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC下ESB對Psa的作用效果。通過菌液光密度繪制Psa生長曲線、電導率儀測定培養(yǎng)液上清電導率、考馬斯亮藍法檢測胞外可溶性蛋白含量、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒檢測AKP活性、硫酸亞鐵法測定菌體對磷的代謝、氧化還原反應測定呼吸鏈脫氫酶活性、0.3%固體培養(yǎng)基檢測Psa泳動能力;掃描電鏡和透射電鏡觀察Psa在MIC處理下的形態(tài)變化。【結(jié)果】5種ESB濃度作用下的抑菌圈直徑均在16.00 mm以上，MIC和MBC均為2.4 mg/mL。ESB能抑制Psa生長，破壞細胞膜和細胞壁，造成電解質(zhì)、蛋白質(zhì)外泄，干擾菌體正常的物質(zhì)和能量代謝;ESB可顯著抑制Psa泳動能力，阻礙細胞的遷移。掃描電鏡和透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，ESB作用后的Psa菌體形態(tài)出現(xiàn)縮短、凹陷、畸形、破裂，細胞質(zhì)外泄，菌體大量裂解等現(xiàn)象。【結(jié)論】ESB可破壞Psa的細胞結(jié)構(gòu)，干擾物質(zhì)和能量代謝，抑制菌體生長，具有開發(fā)成植物源殺菌劑的潛力。

關鍵詞： 黃芩;乙醇提取物;獼猴桃潰瘍病致病菌;抑菌機理

中圖分類號： S436.634.12? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）02-0477-09

Primary antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis against the pathogens of kiwifruit canker

PEI Hu-rong， LU Ming-xiu， LONG Li， LONG Zhang-fu

（College of Life Sciences， Sichuan University， Chengdu? 610064， China）

Abstract：【Objective】To explore the antibacterial mechanism of ethanol extract of Scutellaria baicalensis （ESB） on? the pathogen of kiwifruit canker against Pseudomonas syringae pv. actinidiae （Psa） and to provide a theoretical foundation for the development of new plant-derived fungicides. 【Method】The sensitivity of Psa to ESB was evaluated by the agar punch method. The minimum inhibitory concentration （MIC） and the minimum bactericidal concentration （MBC）were determined by gradient dilution method in liquid medium. The effect of ESB on Psa at 1/4 MIC， 1/2 MIC， 3/4 MIC and MIC was determined. Growth curre was drawn by monitored optical density of the bacterial cullture. Electric conductivity of culture supernatant was measured by conductivity meter. Extracellular soluble protein content was determined by the Coomassie brilliant blue method. Alkaline phosphatase （AKP） activity was measured with an AKP kit.Phosphorus metabolism was detected by the ferrous sulfate method. Respiratory chain dehydrogenase activity was detected by oxidation-reduction reaction. Swimming motility ability was detected in 0.3% solid medium. Scanning electron microscope （SEM） and transmission electron microscope （TEM） were performed to observe Psa morphology at MIC. 【Result】The inhibition zone diameter of ESB against Psa was above 16.00 mm. The MIC and MBC were 2.4 mg/mL. ESB inhibited the growth of Psa， damaged the cell membrane and cell wall which caused the leakage of proteins and electrolytes. Moreover， the ESB interfered with normal material and energy metabolism. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. ESB can significantly resist the swimming of Psa and hinder cell migration. Scanning electron microscopy and transmission electron microscopy showed that morphology of Psa was shortened， depressed， deformed and lysed with ESB， which caused the leak of cytoplasm and bacterial lysis. 【Conclusion】ESB inhibit the normal growth of Psa by destroying the structure of Psa and interfering with substances and energy metabolism. ESB has the potential to be developed as a plant-derived fungicide.

Key words： Scutellaria baicalensis; ethanol extract; Pseudomonas syringae pv. actinidiae; antibacterial mechanism

Foundation items： The National Key Research and Development Program of China（2017YFD0201105）; Sichuan University-Luzhou Strategic Cooperation Project （2020CDLZ-22）

0 引言

【研究意義】自1984年首次報道獼猴桃潰瘍病至今，獼猴桃潰瘍病已蔓延至全球，給全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失（Wicaksono et al.，2018）。我國獼猴桃種植面積廣闊，四川等主要獼猴桃種植區(qū)已受到該細菌性病害影響（王麗等，2017）。如何有效、安全地控制獼猴桃潰瘍病已受到種植者的廣泛關注。目前控制獼猴桃潰瘍病的方法主要是施用鏈霉素和含銅化合物，該方法易導致耐藥菌產(chǎn)生、環(huán)境污染和藥物殘留等問題（Cameron and Sarojini，2014）。植物中含有豐富的天然活性成分，其毒副作用小，不易產(chǎn)生抗藥性，市場前景廣闊（郜玉鋼等，2019;祁高展等，2020;Simonetti et al.，2020）。因此，研發(fā)新型、高效、安全的獼猴桃潰瘍病殺菌劑對獼猴桃的安全生產(chǎn)具有重要意義。【前人研究進展】丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae，Psa）是一種好氧型革蘭氏陰性植物致病細菌，是造成獼猴桃潰瘍病的主要原因（Ferrante and Scortichini，2015;Wicaksono et al.，2018;He et al.，2019;Sawada and Fujikawa，2019）。Young（2012）提出采用育種的方法選育抗Psa獼猴桃植株。Monchiero等（2015）研究發(fā)現(xiàn)在獼猴桃生長階段使用含銅化合物能有效預防獼猴桃潰瘍病。Scortichini（2018）也發(fā)現(xiàn)氯氧化銅和硫酸銅能有效控制Psa。Brunetti等（2020）通過體外試驗和植物試驗發(fā)現(xiàn)三乙膦酸鋁和阿拉酸式-S-甲基2種農(nóng)藥能有效抑制Psa生長，降低獼猴桃潰瘍病的感染率。抗病植株選育費時費力，銅類化合物和農(nóng)藥的大量使用會導致環(huán)境污染和藥物殘留（Colombi et al.，2017）。有關學者正在努力尋找更有效、安全的方法控制獼猴桃潰瘍病，如內(nèi)生細菌（Wicaksono et al.，2018）、天然產(chǎn)物（Lovato et al.，2019）和特異性噬菌體（Slater and Frankel，2020）篩選等。黃芩（Scutellaria baicalensis）作為我國傳統(tǒng)中藥，其應用廣泛。趙寶穎（2012）采用柱層析等方法獲得黃芩乙醇提取物中的21種單一化合物，抗菌試驗發(fā)現(xiàn)提取物對水稻紋枯病菌等植物病原菌有明顯的抑制作用。張偉等（2018）研究證實豬鏈球菌感染的細胞在黃芩提取物作用下存活率極大提升。Shen等（2018）采用高效液相色譜法獲得黃芩的主要成分黃酮類化合物及其衍生物，包括黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷和漢黃芩素等。Trinh等（2018）、Da等（2019）發(fā)現(xiàn)黃芩中的物質(zhì)能有效抑制黑曲霉、米曲霉、煙曲霉、白色念珠菌、熱帶念珠菌和光滑念珠菌等病原真菌。郭澤宇（2020）、蔣長軍等（2021）發(fā)現(xiàn)黃芩苷能抑制嗜水氣單胞菌和大腸桿菌生長及生物膜的形成。姚雪等（2020）采用90%乙醇回流法提取黃芩中的有效成分，分離鑒定出14種黃酮類化合物。Do等（2021）發(fā)現(xiàn)漢黃芩素在體外能顯著抑制米曲霉生長，500 μg/mL漢黃芩素對稻瘟病菌的抑制率高達63%;黃芩素對青枯菌在內(nèi)的3種植物致病菌的最低抑菌濃度（MIC）為19 μg/mL。【本研究切入點】Psa是造成獼猴桃潰瘍病的主要原因，獼猴桃感染Psa后致死率高，尚無有效的控制方法，迫切需要開發(fā)新型藥物控制Psa。目前，黃芩對Psa抑制作用的相關研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】測定黃芩乙醇提取物（Ethanol extract of S. baicalensis，ESB）對Psa生長、細胞壁、細胞膜、物質(zhì)代謝、能量代謝、泳動能力及細胞形態(tài)的影響，揭示ESB抗菌機理，為黃芩活性物質(zhì)的開發(fā)利用和新型植物源殺菌劑的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試植物材料及預處理 黃芩購自成都武侯區(qū)中藥店，采用冷浸法制備黃芩乙醇粗提物（Lin et al.，2016）。黃芩粉碎過40目篩，按照溶劑∶干粉=10∶1（v/m）的比例加入無水乙醇室溫浸泡。收集濾液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃水浴下進行濃縮，獲得浸膏，4 ℃保存待用。

1. 1. 2 供試菌株 Psa由四川大學生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室保藏，于28 ℃下180 r/min搖床中培養(yǎng)。采用特異性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1對致病菌進行鑒定（Andersen et al.，2018）。

1. 1. 3 培養(yǎng)基 KB培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基添加15.0 g瓊脂）：蛋白胨20.0 g，甘油10 mL，K₂HPO₄1.5 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，去離子水1000 mL，自然pH，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1. 1. 4 主要試劑與儀器設備 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）（生工生物工程（上海）股份有限公司）;堿性磷酸酶（AKP）試劑盒（南京建成生物工程研究所）;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（濟南來寶醫(yī)療器械有限公司）;R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;中藥高速粉碎機（浙江蘭溪市偉能達電器有限公司）;AHC電子天平（上海友聲衡器有限公司）;LD-B50L型高壓滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設備有限公司）;SW-CJ-2D超凈工作臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司）;RGX型人工氣候培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;Thermo Multiskan連續(xù)波長酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）;UV-5500紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）;DDS-11A電導儀（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 ESB抑菌活性測定 用二甲基亞砜（DMSO）溶解黃芩粗提物配制100 mg/mL的ESB母液，過濾除菌備用。Psa活化并培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用生理鹽水調(diào)整菌體濃度為10⁷CFU/mL。瓊脂打孔法測定50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 mg/mL（DMSO稀釋）ESB的抑菌效果，以等量DMSO作對照。28 ℃培養(yǎng)24 h，十字交叉法測量抑菌圈大小。

1. 2. 2 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測定 參考Yang等（2005）采用梯度稀釋法測定ESB的MIC和MBC。取對數(shù)生長期的Psa菌液，液體KB培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為107 CFU/mL，加入ESB使藥物終濃度分別為0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6和4.0 mg/mL，另設對應體積的加藥培養(yǎng)基（不加Psa）作為空白對照，DMSO為陰性對照。28 ℃培養(yǎng)24 h，使用酶標儀測定600 nm波長處的吸光值。試驗組與空白組吸光度無明顯差異的濃度定義為MIC（Lovato et al.，2019）。吸取100 μL上述培養(yǎng)液涂布，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形成情況。將不長菌落的平板所對應的濃度定義為MBC（Lovato et al.，2019）。

1. 2. 3 細菌抑菌生長曲線測定 將Psa培養(yǎng)至對數(shù)生長期，液體KB培養(yǎng)基調(diào)整菌體濃度為107 CFU/mL。向含菌KB培養(yǎng)基中加入ESB使其終濃度分別為1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC，DMSO為空白對照，28 ℃下180 r/min培養(yǎng)。每隔2 h時取樣，測定600 nm波長處的吸光值。

1. 2. 4 電導率測定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、10和12 h時取樣，4000 r/min離心5 min，棄沉淀，測定上清液電導率。

1. 2. 5 蛋白質(zhì)泄漏測定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、3、6、9、12和15 h時取樣，4000 r/min離心5 min，取上清，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量。

1. 2. 6 堿性磷酸酶（AKP）測定 菌體處理方法同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、1、2、4、6、8和10 h取樣，4 ℃下4000 r/min離心5 min，取上清，按照堿性磷酸酶試劑盒說明書測定AKP含量。

1. 2. 7 磷吸收率測定 以硫酸亞鐵法測定菌液中磷的含量（陳寧，2016）。取對數(shù)生長期菌液0.5 mL與0.5 mL（1 mg/mL）葡萄糖溶液和0.2 mL磷標準液混合。加藥量和培養(yǎng)方式同1.2.3。分別在培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、10和12 h時取0.1 mL菌液，加入1 mL三氯化鐵與硫酸亞鐵的混合液，靜置10 min。4000 r/min離心5 min，取0.2 mL上清液，加入50 μL鉬酸銨溶液，30 ℃水浴15 min，冷卻后測定630 nm波長處的吸光值。

1. 2. 8 泳動能力試驗 參考Lovato等（2019）的方法，配制含ESB的液體KB培養(yǎng)基和含ESB的0.3%固體KB培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含ESB終濃度均為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL，等量的水和DMSO分別作為陰性對照和空白對照。對數(shù)生長期（10⁷CFU/mL）的菌液在不同處理的液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)24 h后，分別吸取2 μL培養(yǎng)液滴加至相應的固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后使用游標卡尺測量并記錄菌落在固體培養(yǎng)基上形成的直徑。

1. 2. 9 呼吸鏈脫氫酶測定 參照陶文卿（2012）的方法稍作改動，取對數(shù)生長期（10⁷CFU/mL）的菌液3 mL，加入1 mg/mL的TTC溶液2 mL搖勻，加ESB處理同1.2.3，28 ℃靜置培養(yǎng)2 h。滴加2滴濃H2SO4終止反應，加入5 mL甲苯振蕩萃取產(chǎn)物，靜置分層后取上層有機相4000 r/min離心5 min，以甲苯為空白對照測量490 nm波長處的吸光值。

1. 2. 10 掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TSM）觀察

取對數(shù)生長期（10⁷CFU/mL）的菌液，加入ESB使終濃度為MIC，等量DMSO為空白對照，搖床培養(yǎng)4 h。5000 r/min離心10 min，棄上清液，收集菌體，用pH 7.2的磷酸緩沖液洗滌3次，3%戊二醛固定。樣本送成都里來生物科技有限公司進行電鏡觀察。

1. 3 統(tǒng)計分析

本研究所涉及的試驗均重復3次。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0和Origin 9.0進行統(tǒng)計分析和圖表制作。計量資料采用平均值±標準差表示，組間顯著性分析采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌種鑒定

利用特異性引物Psa_A1 F2（5'-GCCTCGATGT CGGCGC-3'）和Psa_A1R1（5'-ATTCGATAGAAGAA CTTCTTTGCGTTT-3'）對供試菌株進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。特異性引物Psa_A1 F2和Psa_A1 R1只能以Psa3為模板擴增出132 bp的條帶，其他致病變種無法擴增（Andersen et al.，2018）。結(jié)果獲得132 bp的特異性條帶，說明供試菌株為Psa（圖1）。

2. 2 抑菌圈、MIC、MBC和生長曲線測定結(jié)果

由表1可知，5種ESB濃度下Psa產(chǎn)生的抑菌圈直徑均超過16.00 mm，與對照差異顯著（P<0.05，下同），表明Psa對ESB敏感且具有濃度依賴性。梯度稀釋、吸光度測定和平板涂布確定MIC和MBC均為2.4 mg/mL（表2）。ESB對Psa生長曲線的研究發(fā)現(xiàn)（圖2），前4 h內(nèi)試驗組與對照組間無顯著差異（P>0.05，下同），6 h后試驗組菌體生長速度顯著降低。表明ESB有抑制Psa生長的效果，抑制效果在一定范圍內(nèi)與濃度呈正相關。

2. 3 電導率測定結(jié)果

如圖3所示，0 h時測定電導率發(fā)現(xiàn)，試驗組的電導率均高于對照組，說明ESB能在短時間內(nèi)影響細胞膜的通透性;對照組電導率前期平穩(wěn)，后期呈上升趨勢，可能與菌體的正常裂解、死亡相關;除1/4MIC試驗組外，其他試驗組的電導率均在短時間內(nèi)迅速增加，極顯著高于對照組（P<0.01，下同）。表明ESB影響Psa細胞壁的完整性且能改變細胞膜的通透性。

2. 4 可溶性蛋白測定結(jié)果

如圖4所示，ESB處理Psa 3 h內(nèi)，對照組培養(yǎng)液中的蛋白含量基本沒有變化，而試驗組蛋白含量均高于50 μg/mL，是對照組的9.00倍以上，最高達11.50倍;3～12 h試驗組培養(yǎng)液中的蛋白含量均極顯著高于對照組。表明ESB能迅速破壞Psa細胞膜結(jié)構(gòu)，造成蛋白質(zhì)泄漏，破壞程度在一定范圍內(nèi)與ESB濃度呈正相關。

2. 5 AKP測定結(jié)果

通過AKP試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)（圖5），對照組的AKP活性基本未發(fā)生變化，試驗組均呈前期上升后期穩(wěn)定的趨勢;比較8 h時AKP活性，試驗組1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC處理的AKP活性分別是對照組的7.57、14.43、20.57和27.43倍，達極顯著差異水平。從AKP活性變化可推斷，ESB能在短時間內(nèi)破壞菌體的細胞壁，菌體細胞壁的破壞程度與ESB濃度呈正比。

2. 6 磷代謝測定結(jié)果

磷是生物生長必需元素之一。如圖6所示，試驗組的初始吸光度均高于對照組，可能是ESB中色素等物質(zhì)干擾了吸光度的測定;分析1～10 h吸光度曲線發(fā)現(xiàn)，試驗組1/4MIC、1/2MIC、3/4MIC和MIC處理的吸光度變化值（1 h與10 h吸光度差值）分別為0.001600、0.00860、0.02833和0.03500，對照組為0.07467，試驗組與對照組間均達極顯著差異;分析1～10 h磷代謝曲線斜率，對照組的磷代謝速率明顯高于試驗組。推斷ESB能干擾Psa的磷代謝，影響Psa正常代謝和生長。

2. 7 呼吸鏈脫氫酶測定結(jié)果

呼吸鏈是細胞能量的主要來源，對生物生存至關重要。如圖7所示，對照組在490 nm波長處的吸光度為0.1650±0.0035，加入ESB后Psa在490 nm處的吸光度極顯著下降，隨著ESB濃度的增加，吸光度分別下降至0.0950±0.0026、0.0660±0.0015、0.0350±0.006和0.0327±0.0050，與對照組相比分別下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%。表明ESB可影響Psa呼吸鏈脫氫酶活性。

2. 8 泳動能力試驗結(jié)果

試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)基含ESB濃度超過0.4 mg/mL后即無菌落形成。從圖8和表3可知，以固體培養(yǎng)基培養(yǎng)Psa時，0.2 mg/mL ESB能極大地抑制Psa的泳動能力（4組、5組與3組比較），與DMSO組相比抑制率超過30%（4組與3組比較），最高可達49.7%（5組與3組比較）;同為0.2 mg/mL ESB作用下，Psa在液體培養(yǎng)時受到ESB處理后會顯著影響Psa在固體培養(yǎng)基上的泳動能力（5組與4組比較）。比較1組與2、3組結(jié)果可發(fā)現(xiàn)DMSO處理會造成Psa泳動能力受到影響。通過對Psa在不同情況下泳動能力的分析可知，ESB可顯著抑制Psa泳動能力，阻礙細菌的遷移。

2. 9 病原菌細胞形態(tài)觀察

掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組的Psa細胞結(jié)構(gòu)完整，表面較光滑，無明顯破損，表明DMSO對Psa形態(tài)影響較小（圖9-A）;Psa在ESB MIC處理4 h后，細胞形態(tài)受到嚴重破壞，出現(xiàn)縮短、凹陷、畸形和破裂（圖9-B）。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，DMSO處理后的Psa菌體形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)輕微的凹陷和皺縮，部分區(qū)域出現(xiàn)空洞，但形態(tài)結(jié)構(gòu)相對完整（圖10-A和圖10-B）;ESB MIC處理4 h后，Psa細胞結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)容物流失嚴重，胞質(zhì)密度下降，出現(xiàn)大面積的裂解（圖10-C～圖10-F）。表明ESB影響Psa細胞結(jié)構(gòu)，造成細胞表面受損，內(nèi)容物外泄，抑制Psa生長。

3 討論

通過抑菌圈、MIC和MBC測定可知ESB能顯著抑制Psa生長，抑制效果與濃度呈正相關。部分抑（殺）菌劑作用于細菌菌體后，能改變細胞膜通透性，造成細胞能量代謝失衡、生理活動受阻（Cox et al.，2001）。因此，培養(yǎng)液電導率的變化可反映細胞膜通透性的改變（Li et al.，2014）。本研究結(jié)果顯示，ESB作用下Psa的胞內(nèi)物質(zhì)大量外泄，培養(yǎng)液電導率出現(xiàn)明顯變化。本研究培養(yǎng)液中可溶性蛋白含量的測定結(jié)果與電導率的變化趨勢基本一致，ESB處理后培養(yǎng)液中可溶性蛋白含量顯著增加。蛋白質(zhì)在細胞中發(fā)揮著重要的生理功能，蛋白含量的降低會影響細胞正常的生理功能（Yin et al.，2020）。同時，蛋白質(zhì)的泄漏也是細胞膜完整性被破壞的標志之一（Bajpai et al.，2013）。AKP是一種磷酸水解酶，存在于細胞間質(zhì)中，只有細胞壁遭到破壞后通透性增加，才能在胞外檢測到AKP活性。胞外AKP活性可間接反映細胞壁的通透性變化（劉雪等，2019）。從AKP活性變化可知，ESB處理后Psa細胞壁通透性增加，細胞壁完整性被破壞。

磷參與生物多種化合物的形成，細菌代謝活動中磷的消耗可反映細胞的生長狀態(tài)和代謝情況。從磷消耗曲線可知，試驗組的磷消耗量顯著低于對照組。分析磷消耗曲線的斜率也可得出相似的結(jié)論，對照組磷的消耗速率遠高于試驗組。TTC是一種小分子無色物質(zhì)，能透過細胞膜，在呼吸鏈脫氫酶作用下被還原成紅色的三苯甲酰（TF），該物質(zhì)在490 nm波長處有最大吸收峰（Richter et al.，2007），490 nm波長處的吸光值可反應呼吸鏈脫氫酶活性。本研究4個濃度處理下的Psa呼吸鏈脫氫酶活性與對照組相比分別下降42.31%、59.72%、78.74%和80.16%，說明ESB能抑制呼吸鏈脫氫酶活性，干擾細胞正常的能量代謝，影響細胞生長。細胞的運動性對于細胞膜的形成是必須的（Dressaire et al.，2015），泳動能力的降低會抑制細胞膜的形成（Miao et al. 2021）。Miao等（2021）研究了黃芩苷作用下的銅綠假單胞菌的泳動能力，證明銅綠假單胞菌細胞膜的形成受到抑制。本研究中，當ESB濃度超過0.4 mg/mL時，0.3%固體培養(yǎng)基上無Psa生長，說明ESB能明顯降低Psa的泳動能力，抑制Psa細胞膜形成。掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果說明ESB作用下的Psa細胞結(jié)構(gòu)受到破壞，正常的生長活動受到影響。

天然化合物成分豐富，不會造成環(huán)境污染和藥物殘留，是替代抗生素和銅類化合物的方法之一（Cameron and Sarojini，2014）。黃芩作為我國傳統(tǒng)的中藥，主要成分是黃芩苷和黃芩素等黃酮類化合物及其衍生物（Shen et al.，2018），具有抗菌、抗炎癥等作用（Trinh et al.，2018;Da et al.，2019）。目前關于黃芩中有效成分抗菌試驗已有研究報道（郭澤宇，2020;蔣長軍等，2021;Do et al.，2021），但黃芩對Psa的抑制作用尚無文獻報道。本研究以黃芩為基礎，探究了ESB在細胞結(jié)構(gòu)、物質(zhì)和能量代謝等方面對Psa的影響，有關黃芩抑殺Psa的有效成分還有待進一步研究。

4 結(jié)論

ESB可破壞Psa的細胞結(jié)構(gòu)，干擾物質(zhì)和能量代謝，抑制菌體生長，具有開發(fā)成植物源殺菌劑的潛力。

參考文獻：

陳寧. 2016. 蒜氨酸降解產(chǎn)物的成分分析和抑菌機理研究[D]. 天津：天津科技大學. [Chen N. 2016. Study on the composition analysis and antibacterial mechanism of alliin degradation products[D]. Tianjin：Tianjin University of Science and Technology.]

郜玉鋼，莫琪琪，趙巖，臧埔. 2019. 微生物介導植物次生代謝產(chǎn)物累積及在藥用植物作用機制中的研究進展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，50（10）：2234-2240. [Gao Y G，Mo Q Q，Zhao Y，Zang P. 2019. Microbial mediated accumulation of plant secondary metabolites and its action mechanism in medicinal plants：A review[J]. Journal of Southern Agriculture，50（10）：2234-2240.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019.10.12.

郭澤宇. 2020. 黃芩苷抑制大腸桿菌生物被膜形成的機制研究[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學. [Guo Z Y. 2020. Mechanism research of baicalin inhibiting biofilm formation of Escherichia coli[D]. Zhengzhou：Henan Agricultural University.] doi：10.27117/d.cnki.ghenu.2020.000330.

蔣長軍，管翠翠，胡小敏，姚倫廣，闞云超，邱礽. 2021. 黃芩苷對嗜水氣單胞菌生物膜形成的影響及體內(nèi)外的抑菌作用[J]. 微生物學報，61（7）：2112-2120. [Jiang C J，Guan C C，Hu X M，Yao L G，Kan Y C，Qiu R. 2021. Bacteriostatic and antibiofilm effects of baicalin on Aeromonas hydrophila：In vitro and in vivo evaluation[J]. Acta Microbiologica Sinica，61（7）：2112-2120.] doi：10.13343/j.cnki.wsxb.20200649.

劉雪，何英蘭，胡月英，陳衛(wèi)軍，陳海明，鐘秋平，陳文學. 2019. 3-蒈烯對銅綠假單胞菌的抑菌活性及機理初探[J]. 熱帶作物學報，40（3）：601-608. [Liu X，He Y L，Hu Y Y，Chen W J，Chen H M，Zhong Q P，Chen W X. 2019. Primary antibacterial activity and mechanism of 3-carene against the Pseudomonas aeruginosa[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，40（3）：601-608.] doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2019.03.027.

祁高展，劉紅娜，李貞子，龍玲，王明明. 2020. 大蒜鱗莖浸提液活性成分及對蘋果炭疽病菌的抑制作用[J].? 河南農(nóng)業(yè)大學學報，54（1）：59-63. [Qi G Z，Liu H N，Li Z Z，Long L，Wang M M. 2020. Active constituents of garlic bulb extract and its inhibition on Colletotrichum gloeosporioides[J]. Journal of Henan Agricultural University，54（1）：59-63.] doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.202002 15.007.

陶文卿. 2012. 10-HDA對大腸桿菌抑制機理的研究[D]. 濟南：齊魯工業(yè)大學. [Tao W Q. 2012. Study on inhibition mechanism of 10-HDA to E. coli[D]. Jinan：Qilu University of Technology.]

王麗，周增強，侯琿，方金豹. 2017. 我國獼猴桃細菌性潰瘍病研究分析及防控[J]. 中國南方果樹，46（2）：178-182. [Wang L，Zhou Z Q，Hou H，F(xiàn)ang J B. 2017. Research and analysis，prevention and control of kiwifruit bacterial canker in China[J]. South China Fruits，46（2）：178-182.] doi：10. 13938/j.issn.1007-1431.20160544.

姚雪，程云霞，陳龍，劉偉，王曉，李奉勝，李兵，董紅敬. 2020. 黃芩化學成分的研究[J]. 中成藥，42（11）：2935- 2940. [Yao X，Cheng Y X，Chen L，Liu W，Wang X，Li F S，Li B，Dong H J. 2020. Chemical constituents from Scutellaria baicalensis[J]. Chinese Traditional Patent Medicine，42（11）：2935-2940.] doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2020. 11.021.

張偉，孫忻，張沛，李莉. 2018. 黃芩提取物對豬鏈球菌溶血素抑制作用的試驗[J]. 中國獸醫(yī)雜志，54（7）：52-55. [Zhang W，Sun X，Zhang P，Li L. 2018. The influence of inhibitory effect of Scutellaria extract on suilysin from Streptococcus suis[J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine，54（7）：52-55.]

趙寶穎. 2012. 黃芩地上部分化學成分研究[D]. 齊齊哈爾：齊齊哈爾大學. [Zhao B Y. 2012. Study on chemical constituents of the aerial parts of Scutellaria baicalensis Georgi[D]. Qiqihaer：Qiqihar University.]

Andersen M T，Templeton M D，Rees-George J，Vanneste J L，Cornish D A，Yu J，Cui W，Braggins T J，Babu K，Mackay J F，Rikkerink E H A. 2018. Highly specific assays to detect isolates of Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar 3 and Pseudomonas syringae pv. actinidifoliorum directly from plant material[J]. Plant Pathology，67（5）：1220-1230. doi：10.1111/ppa.12817.

Bajpai V K，Sharma A，Baek K H. 2013. Antibacterial mode of action of Cudrania tricuspidata fruit essential oil，affecting membrane permeability and surface characteristics of food-borne pathogens[J]. Food Control，32（2）：582-590. doi：10.1016/j.foodcont.2013.01.032.

Brunetti A，Pucci N，Modesti V，Lumia V，Latini A，Loreti S，Pilotti M. 2020. In vitro and in planta screening of compounds for the control of Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Actinidia chinensis var. chinensis[J]. European Journal of Plant Pathology，158（4）：829-848. doi：10.1007/ s10658-020-02119-1.

Cameron A，Sarojini V. 2014. Pseudomonas syringae pv. actinidiae：Chemical control，resistance mechanisms and possible alternatives[J]. Plant Pathology，63（1）：1-11. doi：10.1111/ppa.12066.

Colombi E，Straub C，Künzel S，Templeton M D，McCann H C，Rainey P B. 2017. Evolution of copper resistance in the kiwifruit pathogen Pseudomonas syringae pv. actinidiae through acquisition of integrative conjugative elements and plasmids[J]. Environmental Microbiology，19（2）：819-832.? doi：10.1111/1462-2920.13662.

Cox S D，Mann C M，Markham J L，Gustafson J E，Warmington J R，Wyllie S G. 2001. Determining the antimicrobial actions of tea tree oil[J]. Molecules，6（2）：87-91. doi：10.3390/60100087.

Da X，Nishiyama Y，Tie D，Hein K Z，Yamamoto O，Morita E. 2019. Antifungal activity and mechanism of action of Ou-gon（Scutellaria root extract） components against pathogenic fungi[J]. Scientific reports，9（1）：1-12. doi：10. 1038/s41598-019-38916-w.

Do H T T，Nguyen T H，Nghiem T D，Nguyen H T，Choi G J，Ho C T，Le Dang Q. 2021. Phytochemical constituents and extracts of the roots of Scutellaria baicalensis exhibit in vitro and in vivo control efficacy against various phytopathogenic microorganisms[J]. South African Journal of Botany，142：1-11. doi：10.1016/J.SAJB.2021.05.034.

Dressaire C，Moreira R N，Barahona S，Alves de Matos A P，Arraiano C M. 2015. BolA is a transcriptional switch that turns off motility and turns on biofilm development[J]. mBio，6（1）：e02352-14. doi：10.1128/mBio.02352-14.

Ferrante P，Scortichini M. 2015. Redefining the global populations of Pseudomonas syringae pv. actinidiae based on pathogenic，molecular and phenotypic characteristics[J]. Plant Pathology，64（1）：51-62. doi：10.1111/ppa. 12236.

He R，Liu P，Jia B，Xue S Z，Wang X J，Hu J Y，Shoffe Y A，Gallipoli L，Mazzaglia A，Balestra G M，Zhu L W. 2019. Genetic diversity of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains from different geographic regions in China[J]. Phytopathology，109（3）：347-357. doi：10.1094/PHYTO-06-18-0188-R.

Li Y Q，Han Q，F(xiàn)eng J L，Tian W L，Mo H Z. 2014. Antibacterial characteristics and mechanisms of ?-poly-lysine against Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J]. Food Control，43：22-27. doi：10.1016/j.foodcont.2014.02. 023.

Lin H C，Kuo Y L，Lee W J，Yap H Y，Wang S H. 2016. Antidermatophytic activity of ethanolic extract from Croton tiglium[J]. Biomed Research International，2016：3237586. doi：10.1155/2016/3237586.

Lovato A，Pignatti A，Vitulo N，Vandelle E，Polverari A. 2019. Inhibition of virulence-related traits in Pseudomonas syringae pv. actinidiae by gunpowder green tea extracts[J]. Frontiers in Microbiology，10：2362. doi：10.3389/fmicb.2019.02362.

Miao Y，Ishfaq M，Liu Y，Wu Z，Wang J，Li R，Qian F，Ding L，Li J. 2021. Baicalin attenuates endometritis in a rabbit model induced by infection with Escherichia coli and Staphylococcus aureus via NF-κB and JNK signaling pathways[J]. Domestic Animal Endocrinology，74：106508. doi：10.1016/j.domaniend.2020.106508.

Monchiero M，Gullino M L，Pugliese M，Spadaro D，Garibaldi A. 2015. Efficacy of different chemical and biological products in the control of Pseudomonas syringae pv. actinidiae on kiwifruit[J]. Australasian Plant Pathology，44：13-23. doi：10.1007/s13313-014-0328-1.

Richter A K，F(xiàn)rossard E，Brunner I. 2007. Polyphenols in the woody roots of Norway spruce and European beech reduce TTC[J]. Tree Physiology，27（1）：155-160. doi：10. 1093/treephys/27.1.155.

Sawada H，F(xiàn)ujikawa T. 2019. Genetic diversity of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，pathogen of kiwifruit bacterial canker[J]. Plant Pathology，68（7）：1235-1248. doi：10. 1111/ppa.13040.

Scortichini M. 2018. Aspects still to solve for the management of kiwifruit bacterial canker caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae biovar3[J]. European Journal of Horticultural Science，83（4）：205-211. doi：10.17660/ejhs.2018/83.4.1.

Shen J，Li P，He C，Liu H T，Liu Y Z，Sun X B，Xu R，Xiao P G. 2018. Simultaneous determination of 15 flavonoids from different parts of Scutellaria baicalensis and its chemometrics analysis[J]. Chinese Herbal Medicines，11（1）：20-27. doi：10.1016/j.chmed.2018.09.005.

Simonetti G，Pucci N，Brasili E，Alessio V，Iris S，Eleonora C，Gabriella P，Stefania L. 2020. In vitro antimicrobial activity of plant extracts against Pseudomonas syringae pv. actinidiae causal agent of bacterial canker in kiwifruit[J]. Plant Biosystems-An International Journal Dealing with All Aspects of Plant Biology，154（1）：100-106. doi：10. 1080/11263504.2019.1699194.

Slater S L，F(xiàn)rankel G. 2020. Advances and challenges in studying type III secretion effectors of attaching and effacing pathogens[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，10：337. doi：10.3389/fcimb.2020.00337.

Trinh H，Yoo Y，Won K H，Ngo H T，Yang J E，Cho J G，Lee S W，Kim K Y，Yi T H. 2018. Evaluation of in-vitro antimicrobial activity of Artemisia apiacea H. and Scutellaria baicalensis G. extracts[J]. Journal of Medical Microbio-logy，67（4）：489-495. doi：10.1099/jmm.0.000709.

Wicaksono W A，Jones E E，Casonato S，Monk J，Ridgway H J. 2018. Biological control of Pseudomonas syringae pv. actinidiae（Psa），the causal agent of bacterial canker of kiwifruit，using endophytic bacteria recovered from a medicinal plant[J]. Biological Control，116：103-112. doi：10.1016/j.biocontrol.2017.03.003.

Yang S，Shin S，Hahm K，Kim J I. 2005. Design of perfectly symmetric Trp-rich peptides with potent and broad-spectrum antimicrobial activities[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，27（4）：325-330. doi：10.1016/j.ijantimicag.2005.11.014.

Yin L，Chen J，Wang K，Geng Y，Lai W M，Huang X L，Chen D F，Guo H R，F(xiàn)ang J，Chen Z L，Tang L，Huang C，Li N Q，Ping O Y. 2020. Study the antibacterial mechanism of cinnamaldehyde against drug-resistant Aeromonas hydrop-hila in vitro[J]. Microbial Pathogenesis，145：104208. doi：10.1016/j.micpath.2020.104208.

Young J M. 2012. Pseudomonas syringae pv. actinidiae in New Zealand[J]. Journal of Plant Pathology，94（1）：1-5. doi：10.4454/jpp.v94i1sup.002.

（責任編輯 麻小燕）