超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析鐵皮石斛莖部鮮樣中的酚酸類物質(zhì)的技術(shù)及應(yīng)用

黃 彪 吳建鴻

（1.福建省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,福建 福州 350003）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）為蘭科石斛屬草本植物，是我國傳統(tǒng)的中草藥，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國許多區(qū)域如廣東、福建、海南、浙江等地都有野生資源及人工栽培。鐵皮石斛的利用一般是將其莖部位烘干后加工成石斛楓斗、膠囊、石斛粉以供藥（食）用，也有將其新鮮莖部壓榨調(diào)配成飲品進(jìn)行食用?，F(xiàn)代藥理研究表明，鐵皮石斛具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫等作用[1-3]。鐵皮石斛中的活性成分包括多糖[4]、生物堿[5]、聯(lián)芐衍生物[6]、氨基酸[7]、菲[8]、類黃酮[9]、酚酸[10]等。酚酸是一類分子結(jié)構(gòu)中含酚羥基與羧基的多酚類化合物，作為植物的次級代謝產(chǎn)物，在植物組織中廣泛存在，對植物的生理活動(dòng)有著重要的影響。相關(guān)研究表明，酚酸類化合物具有良好的抗氧化、防癌抗癌、殺菌、抗炎等功效[11]。目前有關(guān)鐵皮石斛中酚酸類物質(zhì)的研究報(bào)道較少[22]，因而研究分析鐵皮石斛中酚酸類物質(zhì)的組成和含量具有重要的意義。

目前報(bào)道的檢測方法主要有高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）[11]、高分辨質(zhì)譜法（high resolution mass spectrometry,HRMS）[12]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS）[13-14]。相對于HPLC，HPLC-MS/MS的選擇性更好，靈敏度更高，抗干擾能力更強(qiáng)，檢測更迅速，其在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測、環(huán)境污染物監(jiān)測、功能性食品活性成分的分析鑒定等方面發(fā)揮著越來越重要的作用。

隨著人們對養(yǎng)生健康日益重視，鑒于鐵皮石斛重要的藥用價(jià)值和保健價(jià)值，鐵皮石斛多樣性產(chǎn)品也被不斷開發(fā)出（如鐵皮石斛鮮條、鐵皮石斛花、鐵皮石斛酒等），食用方法也多樣化（烘干后食用或鮮食）。近些年鐵皮石斛各類產(chǎn)品的營養(yǎng)功能成分方面的研究越來越深入，但目前對鐵皮石斛活性組分的研究大多集中在鐵皮石斛加工后干樣中活性物質(zhì)總含量的分析，而對其采收后鮮樣中活性組分的組成和含量分析的研究則相對較少，有關(guān)鐵皮石斛中酚類組分或酚酸類組分的分析研究報(bào)道更少。本研究在相關(guān)方法的基礎(chǔ)上，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定鐵皮石斛莖部鮮樣13種酚酸類物質(zhì)的方法，以期為鐵皮石斛中活性成分的檢測與利用提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

本研究中使用的主要儀器包括UPLC H-Class超高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Xevo TQ-S三重四級桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）、Millipore Direct-Q5超純水儀（蘇州賽恩斯儀器發(fā)展有限公司）、SYG-2水浴恒溫振蕩器（常州朗越儀器有限公司）、XW-80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品材料采集自福建省龍巖市連城縣、福州市閩侯縣鐵皮石斛產(chǎn)區(qū)，共6份鐵皮石斛莖部樣品（鮮樣）。

13種酚酸類化合物固體標(biāo)準(zhǔn)品：水楊酸（salicylic acid）、對羥基苯甲酸（p-hydroxybenzoic acid）、2,5-二羥基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid）、3,5-二羥基苯甲酸（3,5-dihydroxybenzoic acid）、綠原酸（chlorogenic acid）、香草酸（vanillic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、丁香酸（syringate）、對香豆酸（p-coumalic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、芥子酸（sinapic acid）、2-羥基肉桂酸（2-hydroxycinnamic acid）、3-羥基肉桂酸（3-hydroxycinnamic acid），純度≥97%，南京道斯夫生物技術(shù)股份限公司生產(chǎn)。甲醇、乙腈，質(zhì)譜純，美國Merck公司；乙酸銨、甲酸，質(zhì)譜純，美國Waters；Waters BEH C18柱、Waters T3 C18柱，Waters公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取一定量的各酚酸類化合物固體標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，配制成1 000 mg/L的各酚酸類化合物單標(biāo)母液，然后稀釋母液配制成10.0 mg/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于-20 ℃冰箱中保存。5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液由各單標(biāo)溶液經(jīng)甲醇稀釋混合，實(shí)驗(yàn)前現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

色譜柱為Waters T3 C18柱（50 mm×1.8 mm，5 μm），柱溫保持在30.0 ℃，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為4 μL。流動(dòng)相A為0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液，流動(dòng)相B為乙腈。流動(dòng)相梯度洗脫條件：0～4 min，30%～90% A；4～6 min，維持30% A；5～8 min，30%～50% A；8～9 min，50%～90% A；9～10 min，維持90% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

檢測方式是電噴霧離子源負(fù)離子（ESI-）模式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓為1.5 kV；錐孔氣流為氮?dú)?，流?0 L/h；脫溶劑溫度為500 ℃，流速800 L/h；離子源溫度為150 ℃；霧化氣壓力為0.28 MPa；碰撞氣為高純氬氣。質(zhì)譜檢測定性、定量離子對及優(yōu)化后的錐孔電壓和碰撞能量等具體參數(shù)見表1。

表1 酚酸類化合物檢測的質(zhì)譜參數(shù)條件

1.5 樣品前處理

鐵皮石斛中酚酸類組分的提取參考李巖等[9]（2018）的方法。稱取0.5 g磨碎后的鐵皮石斛鮮樣置于棕色錐形瓶中，加入70%甲醇水溶液10 mL,置于恒溫振蕩器中于70 ℃水浴條件下振蕩提取30 min，自然冷卻至室溫。將提取液轉(zhuǎn)移至離心管中，離心5 min（轉(zhuǎn)速5 000 r/min）后上清液轉(zhuǎn)移至10 mL的棕色容量瓶中。再將樣品用70%甲醇水溶液重復(fù)提取一次，合并提取液，定容至25 mL、搖勻。鐵皮石斛樣品提取液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用Waters MassLynx軟件進(jìn)行處理并用Excel 2007進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在質(zhì)譜儀上采用流動(dòng)注射泵直接進(jìn)樣方式對13種酚酸類組分檢測的質(zhì)譜條件進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧優(yōu)化。用500.0 μg/L或者1 000.0 μg/L（根據(jù)各組分相應(yīng)信號）各酚酸類化合物的單標(biāo)溶液進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，以確定特征母離子和子離子對。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及酚酸類物質(zhì)的官能團(tuán)特點(diǎn)在ESI-模式下進(jìn)行分析，在子離子掃描模式以及優(yōu)化的碰撞能量和錐孔電壓等質(zhì)譜參數(shù)下，優(yōu)化獲得每種酚酸類組分穩(wěn)定且強(qiáng)度高的兩對離子對。

2.2 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)中，分別使用Waters BEH C18柱和Waters T3 C18柱，考察在不同的流動(dòng)相體系（甲醇+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸銨水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液）下所得13種酚酸類組分的峰型和響應(yīng)信號。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Waters T3 C18對酚酸類化合物有更好的分離效果，峰型尖銳。從多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖（如圖1）也可看出，在所檢測的目標(biāo)化合物中，3,5-二羥基苯甲酸與2,5-二羥基苯甲酸，3-羥基肉桂酸與2-羥基肉桂酸互為同分異構(gòu)體，其峰型雖然相似，但是保留時(shí)間有一定的差別，說明在優(yōu)化的條件下，這些同分異構(gòu)體也能被T3 C18柱很好地分離，不會(huì)造成檢測干擾。

2.3 流動(dòng)相體系的選擇

為考察在不同的流動(dòng)相體系下酚酸類組分的峰型及響應(yīng)甲信號，對不同流動(dòng)相體系（甲醇）+0.1%甲酸水溶液、甲醇+5 mmol/乙酸銨水溶液、甲醇+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、乙腈+5 mmol/乙酸銨水溶液、乙腈+0.1%甲酸-5 mmol/乙酸銨水溶液進(jìn)行考察。結(jié)果表明：采用0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相，在負(fù)離子掃描模式下，大多數(shù)酚酸類化合物色譜峰基線相對平穩(wěn)，有良好的峰型及有更好的響應(yīng)信號。各組分的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖如圖1。其原因可能是甲酸的加入有利于抑制酚酸類化合物氫離子的電離，減少其與色譜柱中填料中的基團(tuán)的靜電作用，改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象；而乙酸銨的加入有利于酚酸類化合物負(fù)離子的形成，能增強(qiáng)響應(yīng)信號。

圖1 13種酚酸類目標(biāo)化合物多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限及定量限

根據(jù)酚酸類化合物調(diào)諧優(yōu)化檢測參數(shù)時(shí)的響應(yīng)情況，配制不同質(zhì)量濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到5個(gè)梯度水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。以各目標(biāo)組分響應(yīng)信號對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X,μg/L），得出13種酚酸類組分的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程。如表2所示，13種酚酸類組分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，決定系數(shù)大于0.996。檢出限（LOD）范圍為0.5～5.6 μg/L（S/N≥3），定量限（LOQ）范圍為1.5～15.2 μg/L（S/N≥10）。方法具有較低的檢出限和定量限。

表2 13種酚酸類目標(biāo)化合物檢測的線性關(guān)系、檢出限及定量限

另外，在LC-MS樣品分析中，基質(zhì)效應(yīng)及共流出組分可能會(huì)影響定量分析的準(zhǔn)確度。在所分析的組分中，酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)相似，部分酚酸類化合物的保留時(shí)間非常接近，實(shí)驗(yàn)中為考慮共流出組分可能存在的相互影響，將待分析酚酸類化合物混標(biāo)中該組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率（k0）與單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（k1）進(jìn)行了比較，其比值在0.90～1.10之間。用k0/k1的比值來確定基質(zhì)效應(yīng)，比值越接近1，基質(zhì)效應(yīng)越小。一般認(rèn)為，斜率比在0.80～1.20之間，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)或者共流出組分影響不明顯；反之，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對定量檢測具有較大的影響，不可忽略。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，基質(zhì)效應(yīng)確實(shí)有一定影響，但斜率比在0.90～1.10之間（如圖2），對結(jié)果分析影響不明顯。

圖2 共存組分的影響考察

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

根據(jù)樣品中酚酸類化合物的含量及標(biāo)準(zhǔn)，按照低、中、高水平加標(biāo)確定各化合物的加標(biāo)量，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)加標(biāo)水平重復(fù)6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，13種組分的加標(biāo)回收率范圍為74.8%～95.2%，相應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～6.9%。由此可見，實(shí)驗(yàn)加標(biāo)回收率在70%～110%之間，回收率滿足檢測方法要求。

2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

隨機(jī)選擇1份樣品提取液，按照建立的方法進(jìn)行分析檢測，平行進(jìn)行6次測試。結(jié)果表明，所得酚酸類組分?jǐn)?shù)據(jù)RSDs在0.046%～0.79%之間，說明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的日內(nèi)精密度，符合分析測定的要求。

2.7 鐵皮石斛樣品的檢測

將采集的樣品經(jīng)前處理后，按所建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）對鐵皮石斛樣品進(jìn)行檢測分析。每次進(jìn)樣量為4μL，重復(fù)測定3次取平均值。鐵皮石斛莖部鮮樣中所含酚酸類化合物的檢測結(jié)果如表2所示，鐵皮石斛莖部鮮樣共檢出7種酚酸類化合物，其含量在0.187～38.523 mg/kg范圍。在所分析的樣品中，阿魏酸含量最高，含量為30.32～38.523 mg/kg，其次是芥子酸、丁香酸、水楊酸等，對香豆酸的含量最低。

表3 鐵皮石斛鮮樣莖部中酚酸類化合物組分及其含量（n=3，單位：mg/kg）

3 結(jié)論與討論

相對于高效液相色譜法（HPLC），超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS-MS）具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)、檢測線性范圍寬、分析快速的等特點(diǎn)，能夠較好地實(shí)現(xiàn)樣品中多組分的快速定性、定量分析，在糧油、中草藥、功能性食品相關(guān)檢測方面發(fā)揮出越來越大的作用。鐵皮石斛作為“九大仙草之首”，具有良好的保健和藥用價(jià)值。藥典中以石斛多糖、甘露糖及醇浸出物作為鐵皮石斛質(zhì)量控制的指標(biāo)。而現(xiàn)代科學(xué)研究表明，鐵皮石斛中其他功能性成分如石斛堿、植物酚類、黃酮類和酚酸類等也有重要生理活性作用。酚酸類化合物含量被認(rèn)為與自由基清除、抗氧化、抗衰老相關(guān)，但是相關(guān)對鐵皮石斛鮮樣中酚酸類化合物的研究較少。原因在于植物性農(nóng)產(chǎn)品鮮樣中所含水分較多且其功能性成分含量較低，諸多儀器的靈敏度較難達(dá)到；另一方面由于酚酸類化合物種類較多，而有些酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)較為類似，在樣品中的含量高低差別卻往往較大，從而較難實(shí)現(xiàn)不同含量酚酸類化合物的同時(shí)檢測。

本研究建立了同時(shí)、快速檢測13種酚酸類化合物的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS-MS），分析了鐵皮石斛莖部鮮樣中多種酚酸類物質(zhì)的含量。該方法快速、準(zhǔn)確，可為鐵皮石斛或者其他植物性農(nóng)產(chǎn)品中的酚酸類物質(zhì)的檢測提供參考。