冠心病不同分型患者巨噬細胞凋亡和M1/M2極化水平變化的研究

龔兆會，趙新軍，羅川晉，褚慶民，吳偉，李榮

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病具有高發病率、高病死率的特點，其病理基礎為動脈粥樣硬化（AS）。AS斑塊由穩定轉為不穩定，繼而破裂導致血栓形成是急性冠狀動脈綜合征最主要的發病機制［1-2］。巨噬細胞是破裂斑塊的主要細胞成分，斑塊的纖維帽中侵入的巨噬細胞越多，斑塊就越脆弱，巨噬細胞浸潤程度與冠脈病變的嚴重程度密切相關［3-5］。巨噬細胞極化在AS的形成過程中也起著重要作用，巨噬細胞向M1或M2分化可發揮促炎或抗炎截然相反的作用，巨噬細胞極化失衡是斑塊不穩定的重要原因［6-8］。臨床上冠心病的早期診斷和不同類型冠心病的早期鑒別均非常重要，冠脈造影雖為金標準，但因其創傷性和造影劑使用的局限性，無法普遍開展［9-10］。因此有必要探索更多鑒別方法，提高診斷效率。本研究擬對比分析冠狀動脈正常者和不同臨床分型冠心病患者巨噬細胞凋亡和M1/M2極化的差異，探討巨噬細胞凋亡和極化對冠心病的診斷價值，為進一步提高冠心病的診斷和防治水平提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 納入2019年7月—2020年12月在廣州中醫藥大學第一附屬醫院就診的冠心病患者120例，其中穩定型心絞痛（SA）組、不穩定型心絞痛（UA）組和急性心肌梗死（AMI）組患者各40例，同時間段因懷疑冠心病行冠脈造影或冠脈CT檢查未見冠脈明顯狹窄的患者為對照組40例。SA、UA和AMI符合歐洲心臟病學會穩定性冠狀動脈疾病指南和急性冠脈綜合征指南的相應診斷標準［11-13］。患者年齡為18～85歲，相關臨床資料完備，滿足研究需要。排除其他心血管系統疾病如擴張型心肌病、肥厚型心肌病、病毒性心肌炎、肺源性心臟病、高血壓性心臟病、先天性心臟病；其他系統嚴重疾病，包括未能控制的精神疾病；嚴重肝腎功能不全患者；妊娠期或哺乳期女性。本研究已通過醫院倫理委員會審查批準，所有受試者均于研究開始前簽署知情同意書。

1.2 資料收集 收集所有研究對象的臨床資料，包括性別、年齡、身高、體質量、體質量指數（BMI），入組后48 h內丙氨酸轉氨酶（ALT）、血肌酐（Scr）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、超敏肌鈣蛋白I（hs-TnI）和出院前的心臟彩超射血分數（EF）值。分離和培養人外周血單核巨噬細胞：所有研究對象入組后48 h內抽取肘部靜脈血15 mL。Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，加入含10%胎牛血清的RPMI l640培養基（Gibco）和重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子（rhGMCSF，Cali-bio），放入細胞培養箱培養。隔2 d半量換液，培養7 d，獲得貼壁的巨噬細胞，進行細胞凋亡、極化相關指標檢測。

1.3 細胞凋亡情況檢測 采用Annexin V-FITC/PI雙染凋亡試劑盒（美國BD，貨號：BD0073）檢測巨噬細胞凋亡情況。收集各組巨噬細胞，洗滌后加入稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞，細胞懸液中加入Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）染色液，輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min，立即應用FACS Calibur流式細胞儀（美國BD公司）上機檢測。以AnnexinV+/PI-標記早期凋亡細胞，AnnexinV+/PI+標記晚期凋亡細胞，細胞凋亡率為早期凋亡率和晚期凋亡率的總和。

1.4 巨噬細胞極化指標檢測 各組全血標本室溫自然凝固10～20 min，離心機2 000 r/min離心15 min，收集血清，應用人CD68、CD206、人超敏C-C趨化因子2（CCL2）酶聯免疫分析試劑盒（武漢華美公司）檢測血清中CD68、CD206、CCL2水平，其中CD68分子標記巨噬細胞，CCL2/CD68標記M1型巨噬細胞，CD206/CD68標記M2型巨噬細胞。計算M1/M2比值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 23.0軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，滿足正態分布者多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗；非正態分布者采用M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較使用Bonferroni法。計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。Logistic回歸分析巨噬細胞凋亡率、M1/M2比值對冠心病和UA的影響，繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析其診斷價值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較 AMI組較對照組、SA組和UA組hs-TnI和CK-MB升高，EF降低（P＜0.01）；對照組、SA組、UA組間hs-TnI、CK-MB差異均無統計學意義。UA組和SA組EF比較差異無統計學意義，但均較對照組降低（P＜0.01）。4組性別、年齡、身高、體質量、BMI、ALT、Scr比較差異均無統計學意義，見表1。

2.2 巨噬細胞凋亡情況比較 對照組、SA組、UA組和AMI組巨噬細胞凋亡率（%）分別為5.98（2.99，

24.25）、34.79（25.59，37.50）、44.01（39.01，48.25）、48.55（42.71，55.90），4組逐次升高（H=85.477，P＜0.01）。見圖1。

2.3 巨噬細胞表型分化情況 對照組、SA組、UA組和AMI組M1型巨噬細胞比例和M1/M2比值逐次升高（P＜0.05）；對照組與SA組M2型巨噬細胞比例差異無統計學意義，但均高于UA組和AMI組，UA組與AMI組間差異無統計學意義，見表2。

2.4 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對冠心病的預測價值 以是否患冠心病（SA、UA、AMI組=1，對照組=0）為因變量，以巨噬細胞M1/M2比值、巨噬細胞凋亡率為自變量，Logistic回歸結果顯示巨噬細胞M1/M2比值、巨噬細胞凋亡率升高為冠心病發病的危險因素，見表3。以SA組、UA組、AMI組為陽性樣本，對照組為陰性樣本，ROC曲線顯示，巨噬細胞M1/M2比值和凋亡率預測冠心病的曲線下面積（AUC）分別為0.835、0.898，兩者聯合預測的AUC為0.926，見表4、圖2。

Tab.1 Comparison of general information between the 4 groups of patients表1 4組患者一般臨床資料比較 （n=40）

Fig.1 Macrophage apoptosis in the four groups圖1 各組巨噬細胞凋亡情況

2.5 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對UA的預測價值 以冠心病心絞痛的穩定與否（UA組=1，SA組=0）為因變量，以巨噬細胞M1/M2比值、巨噬細胞凋亡率為自變量，Logistic回歸結果顯示巨噬細胞M1/M2比值、巨噬細胞凋亡率升高為UA發生的危險因素，見表5。以UA組為陽性樣本，SA組為陰性樣本，建立ROC診斷分析模型，結果顯示，巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率預測UA的AUC分別為0.807、0.796，兩者聯合預測的AUC為0.862，見表6、圖3。

Tab.2 Comparison of M1,M2 and the ratio of macrophages between the 4 groups表2 4組M1、M2型巨噬細胞比例及其比值比較

Tab.3 Binary Logistic regression analysis of the influence of M1/M2 ratio and apoptosis rate of macrophages on coronary heart disease表3 巨噬細胞M1/M2比值與凋亡率影響冠心病的二元Logistic回歸分析

Tab.4 The ROC analysis results of the predictive value of macrophage M1/M2 ratio and apoptosis rate for coronary heart disease表4 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對冠心病預測價值的ROC結果

Fig.2 ROC analysis curve of the predictive value of macrophage M1/M2 ratio and apoptosis rate for coronary heart disease圖2 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對冠心病預測價值的ROC曲線

Tab.5 Binary Logistic regression analysis of the influence of macrophage M1/M2 ratio and apoptosis rate on UA表5 巨噬細胞M1/M2比值與凋亡率影響UA的二元Logistic回歸分析

Tab.6 The ROC analysis results of the predictive value of macrophage M1/M2 ratio and apoptosis rate for unstable angina pectoris表6 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對UA預測價值的ROC分析結果

Fig.3 The ROC analysis curve of the predictive value of macrophage polarization M1/M2 ratio and apoptosis rate for unstable angina pectoris圖3 巨噬細胞M1/M2比值、凋亡率對UA的預測價值的ROC曲線

3 討論

冠心病患者的病理基礎是AS，針對斑塊中巨噬細胞功能的探討是目前冠心病研究領域的焦點［14］。吸煙、高血壓和高血糖等有害刺激能夠促進黏附分子及各種細胞因子分泌，進而導致單核細胞遷移至內膜下間隙，向巨噬細胞分化［15-16］。巨噬細胞吞噬大量脂質后形成泡沫細胞以減少沉積在動脈壁中的脂質，而當巨噬細胞繼續吞噬超過其處理能力的脂質后便發生凋亡，凋亡的巨噬細胞是構成粥樣斑塊的重要細胞成分［17-18］。凋亡、壞死的巨噬細胞促進斑塊的發展并稀釋纖維帽，構成壞死核心成分，進而導致斑塊不穩定、崩解、破裂，形成急性血栓，發生AMI或急性腦梗死等疾病［3］。由此可知巨噬細胞的凋亡程度與冠心病的進展關系密切。

在冠脈AS進程中，巨噬細胞可在不同因素的刺激下向M1型或M2型分化，同時在M1型和M2型之間可發生相互轉化［19-20］。其中，M1型巨噬細胞主要存在于早期斑塊中，分布于AS斑塊的脂質核心區，與斑塊形成相關，發揮促炎效應［6］；M2型主要分布于遠離脂核的斑塊肩部以及斑塊周邊，其表達的炎性抑制因子增多，致使巨噬細胞清除凋亡細胞能力增強，發揮一定的抗炎效應，促進AS斑塊的穩定和炎癥的修復［20］。因此，M1/M2的比值能反映巨噬細胞極化方向，提示斑塊趨向于穩定還是不穩定，可能與冠心病嚴重程度有相關性。

本研究結果顯示，4組患者在性別、年齡、身高、體質量、BMI、ALT、Scr等方面差異無統計學意義，說明其一般情況無差別，而心肌標志物CK-MB、hs-TnI和心臟彩超EF差異有統計學意義，且與冠心病病情有關，符合疾病發展的趨勢。對照組、SA組、UA組和AMI組的巨噬細胞凋亡率和M1/M2比值逐次升高，提示巨噬細胞凋亡率和M1/M2比值對冠心病嚴重程度判斷具有重要的參考價值。結合ROC曲線的結果，基于巨噬細胞凋亡率和M1/M2比值的聯合應用對于診斷冠心病有較高的特異度和敏感度。但巨噬細胞凋亡和極化并非冠心病獨有，僅以此診斷冠心病不夠嚴謹，目前仍以冠脈造影為金標準［21］，上述檢查可作為不能耐受冠脈造影或冠脈CT檢查患者的輔助診斷，如造影劑過敏患者。

UA極容易轉化為心肌梗死，其遠期預后可能比ST段抬高型心肌梗死更差［21］，然而其與SA的鑒別很大程度上基于患者的癥狀，缺乏客觀的量化指標，尤其一些糖尿病患者等對疼痛感知的下降，部分患者甚至為無癥狀心肌缺血，導致部分UA被忽視，錯過最佳治療時機［22-23］。如前所述，冠狀動脈粥樣硬化斑塊不穩定、冠脈狹窄程度加重，導致心肌缺血缺氧增加，是UA發作心絞痛的主要原因。此時巨噬細胞凋亡增加，極化由M1向M2轉化，以此指標檢測可能提高鑒別UA的能力。本研究顯示，巨噬細胞凋亡率及M1/M2比值均能一定程度預測UA，聯合應用診斷價值更高，提示對于診斷UA有重要意義。

綜上，巨噬細胞凋亡率和極化水平在冠心病中明顯升高，其與冠心病類型和病情嚴重程度有關，兩者聯合對臨床判斷冠心病類型有參考價值。但本研究納入的患者均來自廣州一家醫院且病例數較少，結果可能存在偏倚，因此研究結果還需進一步擴大納入患者范圍和樣本量，予以進一步驗證。這些不足之處將在后續的研究中加以完善。