基于網絡藥理學和分子對接探析淫羊藿-牛膝藥對治療股骨頭壞死的作用機制*

石 威，張俊忠，解鵬超，侯 燕，余 昕，李 磊，姜紅江，，△

1 安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230000；2 山東中醫藥大學；3 濱州市中醫醫院；4 山東省文登整骨醫院

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是由于不同因素破壞了股骨頭的血液供給，導致股骨頭發生局部或完全性缺血，使股骨頭微觀結構如骨細胞、骨髓造血細胞及脂肪細胞壞死，最終導致股骨頭塌陷的病理過程，是骨科最常見的臨床疑難疾?。?］。常見的類型有激素性ONFH、酒精性ONFH 和外傷性ONFH。根據流行病學調查顯示，該病多見于30～50 歲的中青年人群，我國ONFH 患者已有近800 萬人，且近年來本病的發病率呈逐年升高的趨勢，每年新增約15～20 萬病例［2-3］。該病具有極高的致殘率，已經嚴重危害了患者的生命健康并降低了患者的生活質量［4］。

中醫學將ONFH 歸屬為“骨蝕”“骨痿”的范疇，認為ONFH 與肝腎虧虛、經脈瘀阻密切相關，總體治療原則以補益肝腎、強筋健骨、活血化瘀為主［5］。中藥治療ONFH 有療效確切、安全性高的優勢，對ONFH 的防治具有很好的效果，在ONFH 的保髖治療中起到了至關重要的作用［6］。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物，主要功效為補腎壯陽、祛風除濕、強筋健骨。藥理學研究［7-8］表明，淫羊藿具有抗炎、舒張血管、免疫抑制、抗氧化以等作用。牛膝屬于莧科牛膝屬植物，主要功效為活血通經、補肝腎強筋骨、引火下行。藥理學研究證明，牛膝具有促進血管內皮細胞生長、促進成骨細胞分化、預防凝血等作用［9-11］。結合中醫基礎理論和臨床應用，淫羊藿、牛膝相須配對使用符合臨床防治ONFH 的理念，但對其作用機制尚不明確，因此有必要進一步研究。

網絡藥理學是藥理學融合醫學、系統生物學、計算機科學等多學科而形成的一門新學科，能夠全面地反應藥物對疾病網絡的分子作用機制［12］。本研究基于網絡藥理學和分子對接的方法，從淫羊藿、牛膝的化學物質基礎出發，深入挖掘淫羊藿-牛膝藥對調治ONFH 的關鍵靶點和潛在的分子作用機制并進行分子對接驗證，以期更好的為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時為新藥的研發提供新思路。

1 資料與方法

1.1 淫羊藿-牛膝藥對相關靶點篩選通過TCMSP 數據庫［13］檢索中藥淫羊藿、牛膝化學成分，根據藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性指數（drug-likeness，DL）≥0.18［14］兩個ADME屬性值對活性成分進行初步篩選以獲取活性化合物后查找藥物作用的有效蛋白質靶點。

1.2 淫羊藿-牛膝藥對“活性成分——靶點”網絡篩選完蛋白質靶點后，利用Uniprot 蛋白質數據庫（http：//www.uniprot.org）為化合物作用的蛋白質靶點信息進行標準化，使用Cytoscape 3.8.0［15］構建淫羊藿-牛膝“活性成分——靶點”網絡并探究兩者的關系。

1.3 ONFH 相關靶點檢索通過檢索OMIM 數據庫［16］（http：//www.omim.org）、GeneCards數據庫［17］（http：//genecards.org）中ONFH 的潛在靶點，結合DRUGBANK數據庫（https：//go.drugbank.com/）挖掘治療ONFH的臨床藥物作用靶點［18］。合并3個疾病數據庫靶點后，刪除重復值得到ONFH的靶點。

1.4 PPI網絡構建和關鍵靶點篩選為明確淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點與ONFH相關靶點之間的相互作用，運用Venny 2.1.0平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將淫羊藿-牛膝藥對成分靶點與疾病靶點取交集并繪制韋恩圖。運用Cytoscape 3.8.0中的BisoGenet，將淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點和ONFH的靶點分別導入BisoGenet，各生成1 個PPI 網絡，再使用Cytoscape 中Merge取兩者交集網絡，最后利用CytoNCA［19］分析交集網絡并進行網絡拓撲進一步篩選出關鍵靶點。

1.5 淫羊藿-牛膝藥對成分——ONFH 靶點功能與通路的富集分析Metascape 平臺（https：//metascape.org）每月整合多個權威數據庫，更新基因注釋，具備富集分析、構建PPI 網絡的強大功能［20-21］。將淫羊藿-牛膝調治股骨頭壞死的共同靶點錄入Metascape 平臺，獲取其主要的生物學過程和信號通路并進行富集分析，將獲得的四個數據庫資料根據P 值選用TOP20 數據采用微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO富集分析條形圖、KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6 分子對接驗證選擇“活性成分——靶點”網絡中的核心成分與PPI網絡中治療ONFH相關的關鍵靶點蛋白運用PUB 數據庫、PDB 數據庫，結合Autodock Tools 軟件、Autodock-vina1.1.2 軟件進行分子對接，預測靶點蛋白與小分子之間發生的交互作用，進而評價淫羊藿-牛膝藥對活性成分與關鍵靶點之間的對接效果。

2 結果

2.1 淫羊藿、牛膝活性成分與靶點的獲取初步提取淫羊藿化學成分130種、牛膝化學成分176種，經ADME篩選后共獲得淫羊藿有效活性成分23種、牛膝有效活性成分16種，包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、廣玉蘭內酯（magnograndiolide）、漢黃芩素（wogonin）等。淫羊藿有效成分作用靶點459 個，牛膝有效成分作用靶點403個，合并后刪除重復值共得到靶點231 個。利用Cytoscape 3.8.0 對淫羊藿、牛膝藥對活性成分及其作用靶點的關系網絡進行繪制和分析，共獲得270 個節點與901 條關系，節點的面積代表Degree 值大小，面積越大說明該節點越重要。見表1、圖1。

表1 淫羊藿-牛膝主要活性成分

圖1 淫羊藿-牛膝藥對活性成分靶點網絡圖

2.2 ONFH 相關靶點的獲取從GeneCards 數據庫中共獲得ONFH 潛在靶點2033 個，Relevance Score 值越高代表該靶點與疾病聯系更密切。此次研究設定Relevance Score 大于中位數的目標靶點作為ONFH的潛在靶點，在該數據庫中ONFH靶點Relevance Score最大值為99.71，最小值為0.18，中位數為4.74，故設定Relevance Score＞4.74的靶點為ONFH的潛在靶點共1017個。結合OMIM、DrugBank 數據庫補充相關靶點，合并3 個數據庫相關靶點后刪除重復值，最終得到2131個ONFH相關靶點。

2.3 PPI 網絡的構建將篩選出來的藥物有效活性成分靶點與ONFH 疾病靶點取交集，并通過Venny 平臺制作韋恩圖，得到淫羊藿-牛膝藥對藥物成分——ONFH 共同靶點138 個，見圖2。運用Cytoscape 3.8.0 分別構建淫羊藿-牛膝藥對和ONFH 的PPI 網絡，從結果看：淫羊藿-牛膝藥對潛在靶點可能與7865 個靶點產生作用，交互關系有175281 種；與ONFH 相關的靶點共有13263 個，交互關系可達246136 種，取兩者交集網絡，如圖3。運用網絡拓撲后，進行2次篩選出關鍵靶點80個，篩選策略見圖4。

圖2 淫羊藿-牛膝藥對藥物成分ONFH靶點韋恩圖

圖4 淫羊藿-牛膝藥對關鍵節點篩選策略圖

2.4 靶點功能與通路的富集分析應用Metascape數據平臺對上述獲取的80 個淫羊藿-牛膝藥對調治ONFH 關鍵節點進行信號通路分析，借助微生信平臺對結果進行可視化。由結果可見，多個靶點的功能與ONFH 的發生密切相關。淫羊藿-牛膝藥對主要參與的生物學過程包括對無機物的應答（response to inorganic substance）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）、對受傷的應答（response to wounding）、細胞對有機環化合物的應答（cellular response to organic cyclic compound）、對毒性物質的反應（response to toxic substance），見圖5中BP；在細胞組分中，主要作用于細胞膜筏（membrane raft）、膜微區（membrane microdomain）、膜區（membrane region）等，見圖5中CC；相關靶點調節ONFH的功能主要富集于轉錄因子結合（transcription factor binding）、蛋白質結構域特異性結合（protein domain specific binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉錄因子活性，直接配體調節序列特異性DNA 結合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、蛋白激酶結合（protein kinase binding）、細胞因子受體結合（cytokine receptor binding）等，見圖5 中MF。將KEGG 通路結果繪制成氣泡圖，氣泡顏色從青到紅代表Log10（P）值由小到大，氣泡面積代表該通路的基因計數，橫軸代表該通路基因所占有的比值，如圖6 所示，KEGG 富集通路顯示淫羊藿-牛膝藥對防治ONFH 的 通 路 與PI3K-Akt 信 號 通 路、MAPK 信 號 通路、HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、癌癥通路以及破骨細胞的分化等相關。

圖5 淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH作用靶點富集分析條形圖

圖6 淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對接結果選取活性成分——靶點網絡圖中前2個有效成分與關鍵靶點TP53進行分子對接驗證，分子對接結果顯示關鍵活性成分quercetin、kaempferol 與治療ONFH 的關鍵作用靶點TP53 具有較好的結合活性，說明該研究的預測較為可靠。見圖7。

圖7 藥物關鍵成分與核心靶點TP53分子對接結果

3 討論

通過分析表1和圖1可以得出淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH 的核心有效成分可能為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）等。槲皮素是一種類黃酮化合物，存在于諸多植物類中藥材中，淫羊藿和牛膝成分中都含有槲皮素，藥理學研究表明，槲皮素具有抗炎、預防氧化等作用［22］，可通過MAPK 信號通路恢復成骨細胞功能，進而起到骨保護的功能［23-24］。山柰酚是黃酮醇類化合物，也同時包含在淫羊藿、牛膝之中，現代藥理學證明山柰酚具有防治癌癥、抗炎抗氧化等功效。漢黃芩素是從黃芩中提取出來的化合物，研究證明漢黃芩素具有抗炎抗氧化、保護血管等作用［25-26］。ONFH臨床疼痛癥狀多由于炎癥的局部反應所致，而活性物質槲皮素、山柰酚、漢黃芩素在炎癥反應中均具有獨特的生物特性，與治療ONFH的理念不謀而合。

本研究經篩選后共得到80 個關鍵節點。根據Degree 值排名，其中較為重要的靶點有TP53、PPARG、PTGS2 等。有研究表明，產生ONFH 重要因素之一是脂質代謝紊亂，PPARG 正是體內脂肪形成的必要的轉錄因子，密切參與體內脂肪的代謝過程［27-28］。TP53 是一種抑癌基因，密切參與細胞凋亡，研究證實TP53 的高表達與ONFH 有關，其作用機制為上調凋亡因子Bax的表達［29-30］。

由KEGG 通路富集分析結果顯示，淫羊藿-牛膝藥對治療ONFH 主要涉及以下幾個信號通路：PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥通路。1）PI3K-AKT 信號通路：李云隆等［31］認為PI3K通過激活激酶系統促使AKT逐漸被磷酸化，磷酸化后的AKT激活下游靶蛋白mTOR，從而激活該通路可以抑制自噬，進而改善ONFH 的進程。同時該通路已被證實與血管修復再生、成骨細胞分化、破骨細胞分化密切相關［32］。2）MAPK 信號通路：骨代謝失衡是導致ONFH 發生的重要機制，MAPK 是調節骨代謝平衡的重要信號傳導系統，密切參與成骨細胞的增殖分化［33］，同時也是槲皮素干預ONFH 的重要因素［34］。由此可見淫羊藿-牛膝藥對可通過MAPK 信號通路調節骨代謝從而發揮治療作用。3）HIF-1 信號通路：研究證明，缺血缺氧同樣也是導致ONFH 發生的重要機制［35］，HIF-1 信號通路是一種經典的缺氧代謝通路［36］，該信號通路在缺氧時密切參與了血管生成、骨吸收和新骨生成的骨修復過程［37］。

綜上所述，淫羊藿-牛膝藥對調治ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、癌癥通路等，與自噬、缺氧應激、炎癥反應、血管生成、骨代謝等多個生物學過程息息相關，由此可知，淫羊藿-牛膝相須配伍使用并不是簡單的相同成分含量的增加，而是通過信號通路互補，這為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時為新藥的研發提供新思路。