蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠BMD、E2及股骨頭CYP450 的作用*

趙 軍，李 昕，謝靜華，師建平，常 虹

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院

中國古代蒙醫(yī)籍中記載的傳統(tǒng)蒙藥藍刺頭（echinops latifolius），其味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解毒，殺“粘”止痛等功效，主治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創(chuàng)、瘡瘍等癥［1］。本研究在前期研究［2-3］的基礎上進一步探究蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）、血清雌二醇（estradiol2，E2）、股骨頭中芳香化酶P450（aromatase cytochrome P450，CYP450）作用，闡述藍刺頭對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物5 月齡雌性Wistar 大鼠105 只，購于內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心，實驗動物合格證號：SCXK（蒙）2002-0001，標準飼料喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，購回大鼠環(huán)境適應7 天，開始制備動物去卵巢大鼠OP模型。

1.2 試藥與試劑蒙藥藍刺頭制劑原藥購于內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院，由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備膠囊。強骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號：131204，規(guī)格：0.25 g/粒）。己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號：20181120）。E2試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：201809213）；CYP450 試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：201809584）；DAB 顯色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：1292345）；PBS 緩沖液（北京博奧森生物技術有限公司，批號：1321250607）。

1.3 實驗方法90 只大鼠飼養(yǎng)適應7 天后按文獻［4］制備PMOP 大鼠模型。依據(jù)文獻［5-7］觀察大鼠陰道涂片，確定造模是否成功。造模成功后大鼠陰道涂片均處于動情間期，成功復制PMOP 動物模型90 只；假手術組只切除卵巢周邊脂肪，造模成功15 只。隨機法將90 只PMOP 大鼠分為己烯雌酚組，強骨膠囊組，蒙藥藍刺頭低、中、高劑量組，模型組6 組，每組15 只；另設假手術組15 只。藥物各組分別研磨細碎，配制使用蒸餾水。據(jù)人、鼠體質(zhì)量比及人、鼠代謝速率比行計算［3］，強骨膠囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL。蒙藥藍刺頭高、中、低劑量組濃度依次為27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL，高、中、低劑量比例為4∶2∶1，其中低劑量組為臨床有效劑量。為方便配藥，上藥計算為每日灌胃量0.02 mL/g，濃度配成。見圖1。

圖1 光鏡下雌鼠陰道涂片（HE×400）

1.4 檢測指標

1.4.1 標本采集 1）麻醉大鼠后心臟取血，在心尖搏動胸骨左緣處，粗針頭斜向大鼠后背右上方向進針，深度約1.5 cm，防止吸抽過程中紅細胞擠壓溶血，保持速度緩慢均勻，采血5 mL，進行血清E2檢測；2）處死大鼠剖取雙側完整股骨，分離干凈附著的肌肉組織，保留完整骨膜，左側股骨雙能X線測BMD，4%甲醛液將右側股骨浸沒備免疫組織化學實驗用；檢測CYP450 在右側股骨頭中表達［5-10］。

1.4.2 檢測影響骨代謝生化指標 采用顯微CT（Micro-CT）對所有大鼠左側股骨近端干骺端BMD計量學指標進行分析；采用酶聯(lián)免疫反應法測定大鼠血清E2；行免疫組化染色觀察腎上腺CYP450表達，每組大鼠取5 張切片（n0），每張切片隨機選擇5個視野（n1），在光學顯微鏡下觀察各組染色情況。

1.4.3 大鼠股骨脫鈣過程、免疫組化法染色觀察 4%甲醛將大鼠右側股骨固定10天，EDTA脫鈣液配制，在1 000 mL 的燒杯中加入186 g EDTA-2Na·2H2O，189.4 g Na2HPO4、10.6 g NaH2PO4，加水約700 mL，將燒杯放置于加熱攪拌器上并通電，NaOH 20 g 再入，攪拌加熱至65℃，透明澄清液體顏色，測定調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，總量1000 mL定容。錐形瓶中移入大鼠右側股骨，脫鈣液EDTA 加入，液/骨體積比約4∶1，換液定時每2 日1 次，25℃左右室溫，脫鈣連續(xù)20 天，針尖刺入股骨，暢通無阻則完全脫鈣。常規(guī)行免疫組化染色觀察股骨CYP450表達［6］。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 股骨骨密度BMD 水平假手術組，蒙藥藍刺頭中、低劑量組，假手術組，強骨膠囊組，己烯雌酚組與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭高、低劑量組與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組與蒙藥藍刺頭高劑量組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；蒙藥藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術組組間兩兩相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠左側股骨近端干骺端骨密度比較（±s） g/cm3

表1 各組大鼠左側股骨近端干骺端骨密度比較（±s） g/cm3

注：與模型組比較，*表示P＜0.05；與假手術組比較，△表示P＜0.05

組別模型組假手術組藍刺頭高劑量組藍刺頭中劑量組藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15 15 BMD 0.189±0.032△0.400±0.072 0.249±0.235△0.313±0.025*0.245±0.272*0.298±0.437*0.396±0.058*

2.2 血清E2水平與假手術組相比，模型組血清E2水平下降明顯（P＜0.01）。與模型組相比，藍刺頭中、高劑量組，己烯雌酚組，強骨膠囊組血清E2水平均升高明顯（P＜0.01）；藍刺頭低劑量組血清E2水平上升，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與己烯雌酚組比，蒙藥藍刺頭中劑量組血清E2升高，藍刺頭高、低劑量組血清E2降低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與強骨膠囊組比較，藍刺頭中劑量組血清E2水平偏高，藍刺頭高、低劑量組血清E2水平偏低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。藍刺頭高、中、低劑量組之間比較，藍刺頭中劑量組血清E2水平高于藍刺頭高劑量組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；藍刺頭低、中劑量組之間血清E2差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），藍刺頭中劑量組血清E2表達提升明顯。己烯雌酚組E2表達比強骨膠囊組高，但差異無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清E2水平比較（±s） pg/mL

表2 各組大鼠血清E2水平比較（±s） pg/mL

注：與假手術組比較，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.05；與藍刺頭中劑量組比較，☆表示P＜0.05

組別模型組假手術組藍刺頭高劑量組藍刺頭中劑量組藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15 15 E2 21.75±0.37#40.51±2.53 24.45±2.32△35.66±3.46△23.06±1.74☆29.05±2.29△29.94±2.56△

2.3 股骨頭CYP450表達骨細胞組織切片顯示：矮柱狀、立方形的成骨細胞分布藍刺頭中劑量組比模型組明顯增多；多核型破骨細胞藍刺頭中劑量組比模型組明顯減少。表明藍刺頭中劑量組CYP450表達明顯增高。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨頭CYP450表達（HE×400）

與假手術組相比，模型組右側股骨頭免疫組化CYP450 表達明顯減弱（P＜0.01）。與模型組相比，己烯雌酚組，強骨膠囊組，藍刺頭中、高劑量組股骨頭CYP450 均升高明顯（P＜0.05）；藍刺頭低劑量組股骨頭CYP450 升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同己烯雌酚組比，藍刺頭中劑量組股骨頭CYP450 升高，藍刺頭低、高劑量組CYP450 減少，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同強骨膠囊組比較，藍刺頭中劑量組股骨頭CYP450 升高，藍刺頭低、高劑量組CYP450 減少，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。藍刺頭中劑量組股骨頭CYP450表達比高劑量組明顯，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；藍刺頭低、中劑量組股骨頭CYP450表達明顯升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。強骨膠囊組股骨頭CYP450 比己烯雌酚組高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠右側股骨頭CYP450表達比較（±s）μm2

表3 各組大鼠右側股骨頭CYP450表達比較（±s）μm2

注：與假手術組比較，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.05；與藍刺頭中劑量組比較，☆表示P＜0.05

組別模型組假手術組藍刺頭高劑量組藍刺頭中劑量組藍刺頭低劑量組強骨膠囊組己烯雌酚組視野數(shù)25 25 25 25 25 25 25平均光密度值CYP450測定0.109±0.024#0.377±0.037 0.279±0.057△☆0.325±0.035△0.271±0.013△☆0.308±0.075△0.297±0.038△

3 討論

植物來源的食物中，亞麻籽中木脂素的量最高，具有弱的雌激素和抗雌激素活性；木脂素的結構與他莫昔芬相似，有益于骨代謝［11-17］。DOYLE等［18］通過ERβ化學活性螢光素酶表達法研究了產(chǎn)自哥斯達黎加的17 種草藥防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用及機制。結果發(fā)現(xiàn)6 種草藥提取物可與雌激素結合，其中4 種草藥可以刺激雌激素基因表達；6種草藥能夠調(diào)節(jié)MCF-7細胞內(nèi)源基因表達，4種可用作雌激素激動劑，其中眾香樹和菝葜屬植物主要通過增強雌激素調(diào)節(jié)蛋白pS2 mRNA 的表達、降低孕激素受體和PTGES mRNA 表達來發(fā)揮雌激素激動劑或拮抗劑作用，達到治療圍絕經(jīng)期綜合征、防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。補腎、活血化瘀中藥也含有植物雌激素，具有抑制骨吸收和促進骨形成的作用［19-21］。

綜上所述，蒙藥藍刺頭適當濃度具有類雌激素樣作用；藍刺頭能增強股骨頭CYP450 表達；藍刺頭適當濃度具有升高股骨頭CYP450 產(chǎn)生的作用。本研究結果顯示，藍刺頭與強骨膠囊效果相當，說明藍刺頭具類雌激素樣作用，其優(yōu)勢體現(xiàn)在防治PMOP 方面，為蒙醫(yī)藥“補暖補精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論提供實驗依據(jù)。