干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗光合特性的影響

余 欣，童 飛，詹 妮，葉 婷，王 琴，葉 輝，武立權，李 娟

(1.安徽農業大學生命科學學院，安徽 合肥 230036；2.安徽農業大學農學院，安徽 合肥 230036；3.安徽農業大學生物技術中心，安徽 合肥 230036)

水稻(OryzasativaL.)是我國最重要的糧食作物之一，各項統計表明，我國水稻種植規模和產量長期位居全國主要農作物前兩位；中國既是世界上最大的水稻生產大國，也是最大的消費大國，水稻對我國糧食安全具有重要的戰略地位[1]。非生物逆境影響是制約水稻糧食生產的主要限制因子之一。近年來，高溫、干旱、洪澇等全球自然災害頻發且規模大，包括中國在內的亞洲國家，水稻種植面積和單產量受極端天氣影響而下降的現象普遍存在[2]。雙季晚稻秧苗移栽以后正值夏秋高溫季節，此時往往高溫和干旱交替或同時發生，是晚稻生產的主要限制因子。在水稻栽培生產上，如何將不可抗逆的環境因子加以利用已成為水稻抗逆研究的新方向。關于干旱和高溫對水稻生長影響的研究多集中于單一逆境[3-6]或復合逆境[7-9]。越來越多的研究證明，植物受輕度主脅迫影響后可獲得對另一種或多種強脅迫的抗性，這種現象被稱為交叉耐受性或交叉適應性[10]。如熱激處理加強了玉米幼苗對高溫、低溫、干旱及鹽等脅迫的抗性[11-12]；營養期干旱誘導顯著提高了小麥孕穗期的抗寒能力[13]；干旱或高溫預處理可以增強水稻幼苗對高溫或干旱的交叉抗性[14]。有關幼苗期水稻干旱-高溫交叉適應性的研究，主要集中在滲透調節物質與活性氧含量、活性氧清除系統相關酶活等生理指標的測定[14]，在水稻葉片光合作用和葉綠體超顯微結構方面少有報道。本試驗選用水稻品種‘N22’，分析干旱-高溫交叉脅迫處理水稻幼苗葉片葉綠素總量、光合生理參數、葉綠素熒光參數以及葉綠體超微結構的變化，探討干旱-高溫交叉脅迫下水稻幼苗光合作用與葉綠體顯微結構穩定性的關系，為水稻耐旱耐熱品種的選育和逆境栽培提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019年5—7月在安徽農業大學生物科技樓人工氣候箱中進行。以水稻品種‘N22’(OryzastivaL. spp.Aus. CV., ‘Nagina 22’)為試材，挑選籽粒均勻、飽滿的水稻種子，經表面消毒、浸種后置于培養皿中催芽，選取發芽均勻一致的種粒播種于帶網格的塑料盆(高30 cm，直徑25 cm)中，一盆5粒，一共60盆。置于人工氣候箱中(晝/夜溫度25℃/20℃，晝/夜光周期12 h·h-1，光照強度3 000 Lux，相對濕度75%)，盆內盛有1/2 Hoagland營養液，營養液每3 d更換1次，待水稻長至三葉一心期時，選取長勢基本一致的水稻幼苗進行脅迫處理。

1.2 處理方法

本試驗設置正常生長(CK)、單一高溫脅迫(Heat stress，H)及干旱-高溫交叉脅迫(Drought-heat cross stress，DH)3個處理組，處理中除溫度和模擬干旱外，水稻幼苗生長條件均一致。(1)正常生長：人工氣候箱晝/夜溫度為25℃/20℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland營養液；(2)單一高溫脅迫處理：將人工氣候箱晝/夜溫度調至38℃/30℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland營養液，高溫脅迫培養3 d；(3)干旱-高溫交叉脅迫處理：用含10% PEG-6000 1/2 Hoagland營養液模擬干旱脅迫，溶液水勢保持在-0.2 MPa左右，連續干旱脅迫培養3 d后，重新用1/2 Hoagland營養液恢復培育至正常后，轉入晝/夜溫度為38℃/30℃的人工氣候箱中，高溫脅迫培養3 d。以上每處理重復3次，每重復5盆。

1.3 葉綠素總量測定

采集水稻幼苗的第2～3真葉，剪碎、混勻后稱取0.2 g，加入5 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，再加入4 mL 95%的乙醇繼續研磨至葉片組織變白，靜置3～5 min，將全部勻漿轉入10 mL離心管，于室溫下4 000 r·min-1離心10 min后收集上清液，再用95%的乙醇定容至25 mL，以95%的乙醇為對照。紫外-可見分光光度計(UV-3600,島津，日本)分別測定665 nm和649 nm處的吸光值，計算總葉綠素含量(mg·g-1)。

1.4 葉片光合特性測定

選取水稻幼苗第2～3真葉，在上午9∶00—11∶00用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR，美國)在內置LED紅藍光源和1 000 μmol·m-2·s-1光合有效輻射參數條件下，測定其凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.5 葉綠素熒光參數的測定

將水稻幼苗暗適應30 min后，選取第2～3真葉，用新型調制葉綠素熒光成像系統(IMAGING-PAM，WALZ，德國)進行葉綠素熒光測定，主要測定指標是實際光能轉化效率Y(Ⅱ)。

1.6 掃描電鏡觀察

挑選水稻幼苗的第2～3真葉，取葉片主葉脈兩側的部分，用刀切成5 mm×5 mm的小方塊，置入1.5 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液漂洗，用乙醇梯度脫水后用乙酸異戊酯置換。將樣品干燥、噴金，用掃描電子顯微鏡(S4800，日立，日本)觀察拍照。

1.7 透射電鏡觀察

挑選水稻幼苗的第2～3真葉，取葉片主葉脈兩側的部分，用刀切成2 mm×5 mm的小方塊，置入1.5 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS漂洗樣品，1%鋨酸固定，再用PBS漂洗，乙醇梯度脫水，用包埋劑與丙酮混合液滲透，再加熱包埋聚合。用超薄切片機(EM UC7，徠卡，德國)切片，切片經醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡(HT-7700，日立，日本)觀察拍照。

1.8 數據統計分析

所有數據均為3個以上重復(含3個重復)的平均值加標準誤，數據整理使用WPS Excel 2020和SPSS 25.0軟件做顯著性差異分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗法進行處理間的差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗葉綠素總量和葉綠素a/b比值的影響

高溫脅迫會抑制葉綠素合成相關酶的活性，從而降低葉綠素含量。由圖1A可知，在H和DH處理下水稻幼苗的葉綠素總量分別為0.37、1.98 mg·g-1，均低于CK的2.07 mg·g-1，分別下降82.15%和4.44%；而DH處理后的水稻幼苗的葉綠素總量較H處理卻顯著上升(P<0.01)，是H處理下的4.35倍。表明高溫脅迫顯著抑制了水稻幼苗中葉綠素的合成，導致葉綠素的含量顯著下降；而水稻苗期進行干旱預處理，有利于減小后期高溫對葉綠素合成的抑制，從而提高葉綠素的含量，增強水稻的光合作用能力，提高水稻的耐熱性。由圖1B可知，水稻幼苗葉綠素a/b比值在H、DH以及CK中的差異不顯著，分別為3.01、3.15和3.07，表明單一高溫以及干旱-高溫交叉脅迫對葉綠素a/b比值的影響不顯著。

注:CK:正常生長；H:單一高溫處理；DH:干旱-高溫交叉處理，**表示1%水平顯著性，下同。

2.2 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗光合參數的影響

凈光合速率能夠直接反映植物的光合能力。由表1可知，H處理下水稻幼苗凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)均顯著低于CK(P<0.05)，下降幅度分別為66.82%、64.83%、8.23%、66.20%。這說明水稻幼苗對高溫脅迫十分敏感，高溫脅迫導致水稻葉片氣孔導度顯著減小，從而阻止了CO2的供應，使胞間CO2濃度減小，凈光合速率下降。DH處理下，水稻幼苗Pn、Gs、Ci、Tr較H處理顯著上升(P<0.05)，分別是H處理的2.67、3.20、1.17、3.46倍；與CK相比，除Pn略低于CK外，Gs、Ci及Tr較CK有小幅度上升，表明水稻苗期進行干旱預處理可以提高水稻對高溫脅迫的適應性，保證水稻葉片正常光合作用的同時，增強了水稻幼苗的抗熱性。

表1 干旱-高溫交叉脅迫對水稻葉片光合參數的影響

2.3 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗葉綠素熒光參數的影響

高溫會破壞葉片PSII，通過檢測葉綠素熒光可以了解植物的光合狀況，其參數變化可以用來評價植株的抗逆性。由圖2可知，H處理下水稻幼苗葉片葉綠素熒光參數Y(Ⅱ)顯著低于CK(P<0.01)，下降幅度為27.51%。說明高溫逆境顯著影響了水稻幼苗光合作用器官活性，從而使得其實際光能轉換效率受到抑制。而DH處理下水稻幼苗葉片Y(Ⅱ)略低于CK，差異不顯著，但顯著高于H處理(P<0.01)，是H處理的1.23倍。表明水稻苗期進行干旱預處理，提高了高溫脅迫下水稻幼苗光合作用系統活性，干旱-高溫交叉脅迫后的水稻幼苗抗熱性會更強。

圖2 干旱-高溫交叉脅迫對水稻葉片實際光化學量子效率的影響

2.4 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗葉片超微結構的影響

利用掃描電鏡觀察水稻葉片表皮氣孔形態(圖3)。H處理使氣孔大小和氣孔開度均明顯減小，氣孔呈近乎閉合狀態；而DH處理后氣孔大小無顯著變化，氣孔開張度略大于CK，保持正常的氣孔形態。說明水稻苗期進行干旱預處理，可以通過調節氣孔大小和形態來提高其光合作用能力和蒸騰能力，以抵御后期高溫的脅迫。

注：×6.0 k表示放大倍數為6 000倍。

利用透射電鏡觀察水稻葉片葉肉細胞(圖4)。CK組的葉肉細胞形狀完整飽滿，葉綠體呈扁平的橢圓狀，內部基粒片層穩定排列；而H處理組的葉肉細胞壓縮變形，葉綠體膨脹，基粒片層普遍出現斷裂甚至解體；DH處理組的葉肉細胞形狀保持相對完整，葉綠體與CK組相似，呈扁平的橢圓狀，基粒片層結構也相對穩定，無明顯斷裂和解體。水稻苗期進行干旱預處理，有利于維持葉肉細胞及亞細胞器的正常形態，免受后期高溫的傷害。

注：MC：葉肉細胞，Ch：葉綠體，G：葉綠體基粒。×3.0 k、×15 k表示放大倍數為3 000倍、15 000倍。

3 討 論

光合作用直接影響到水稻產量，而葉片是水稻進行光合作用的主要部位，葉片的生長發育狀態關乎水稻光合作用能力的大小，也決定收獲后的生物量和產量。水稻幼苗期以營養生長為主，不利的環境因子會左右其發育狀況。Pandey等[15]和Bunnag等[16]等研究表明，營養生長期的水稻幼苗若長期處于高溫或干旱環境下則會影響其分蘗發生，進而導致有效穗數減少，嚴重影響水稻的品質和產量。楊波等[17]研究也指出水分和高溫復合脅迫下，水稻幼苗光合生理特性會受到顯著影響。利用植物的交叉適應性可以成為改良水稻抗逆性的有效手段之一。前人的研究已經表明，對幼苗期水稻進行干旱或高溫鍛煉，使滲透調節物質積累，明顯提高了活性氧的清除能力，增強了水稻的抗熱性或抗旱性[14]，但干旱-高溫交叉脅迫對水稻光合性能指標的影響鮮有報道。由此可見，進一步從水稻光合作用及葉綠體超微結構入手，探究干旱-高溫交叉適應性下水稻幼苗的光合生理響應機制具有重要意義。

3.1 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗葉綠素的影響

高等植物細胞中光合色素以葉綠素a和葉綠素b為主，它們在光合作用中發揮著吸收和傳遞光能的作用，反映出水稻幼苗的生長狀況和光合作用能力[18]。高溫脅迫主要影響葉綠素中間產物合成，從而導致葉綠素合成減少。在一定范圍內，增加葉綠素含量可以增強葉綠體對光能的吸收與轉化，葉綠素a/b比值反映葉綠素a與葉綠素b對逆境脅迫的敏感性以及逆境脅迫對二者的傷害程度[19]。本研究中單一高溫脅迫下水稻葉綠素含量顯著降低，但干旱-高溫交叉脅迫下水稻葉綠素含量明顯高于單一高溫脅迫后的水稻，說明單一高溫脅迫下水稻幼苗葉綠素合成被抑制，造成了葉綠素含量顯著下降；而當水稻幼苗經過適度干旱鍛煉后，后期高溫對其葉綠素合成的抑制會顯著減弱，葉綠素含量也明顯上升，增強了光能的吸收和轉化能力，從而提高了水稻幼苗對高溫脅迫的適應性。但本研究中各處理間葉綠素a/b比值變化不顯著，說明葉綠素a和葉綠素b對單一高溫以及干旱-高溫交叉脅迫有相似的敏感性。

3.2 干旱-高溫交叉脅迫對水稻幼苗光合參數的影響

光合作用是植物功能中最敏感的部分，熱脅迫降低了植物的光合作用[20]。宋麗莉等[21]研究指出，水稻幼苗在30℃～35℃高溫區間表現為Pn、Gs、Ci、Tr等主要光合參數指標有下降趨勢，與本研究高溫組試驗結果一致，而干旱-高溫交叉脅迫后水稻幼苗的生理參數與正常生長組的參數差異不顯著，表明干旱鍛煉能夠使水稻幼苗在后期高溫脅迫時通過維持適度的氣孔導度、正常的CO2的供應，從而保持適應高溫環境壓力下生存的光合作用強度，進一步驗證了水稻幼苗的干旱-高溫交叉適應性。

3.3 干旱-高溫交叉脅迫對水稻葉片葉綠素熒光參數的影響

實際光能轉換效率Y(Ⅱ)指的是原初反應中光系統Ⅱ(PSⅡ)吸收的光能轉換為電能的利用率，常作為研究環境脅迫對植物光合能力影響的重要指標之一[22-24]。正常生長狀態下，任何植物葉片的熒光參數是不會發生改變的，而當遭受外界逆境脅迫時才會變化以緩解外界傷害。一般來說，脅迫程度越大，PSⅡ受損傷情況越嚴重，進而導致相應的光化學反應效率顯著下降，若植物的抗逆性較強則會表現出其參數下降幅度小[25]。楊衛麗等[26]研究指出，復合體PSⅡ受限是造成高溫脅迫后水稻光合速率下降的主要環節。本研究同樣表明，高溫脅迫下水稻光系統Ⅱ對光能的捕獲及轉換功能受阻，造成光能利用率的極大損耗，而干旱鍛煉使水稻幼苗在應對高溫時光能轉換的損失降到了最小，為光合作用的維持提供了保障，但關于PSⅡ組成部分受脅迫影響的具體機制仍有待進一步探索。

3.4 干旱-高溫交叉脅迫對水稻葉片超微結構的影響

氣孔是水稻等大多數植物與外界O2、CO2、水蒸氣等氣體進行交換的一種特殊結構，用來調節植物光合作用、蒸騰作用。本研究中，高溫處理后的水稻氣孔大小和氣孔開度發生了顯著變化，高溫會使葉片氣孔發生關閉，這一現象在葡萄樹幼苗等其它單子葉植物中也發生[22]，而干旱-高溫交叉脅迫下氣孔則維持正常的生理狀態，其中氣孔開度略有增大，一方面可能是水稻氣孔增大有助于對CO2的吸收，從而補充卡爾文循環中CO2原料的供應，維持光合作用的穩定運作。另一方面，氣孔開度變大也會加強葉片的蒸騰作用，降低水稻表面溫度，緩解高溫傷害。

葉綠體超微結構的變化被認為與光合器官的生理、生化和功能適應性變化密切相關[27]，找出葉綠體變化與光合作用間聯系則是說明水稻在干旱-高溫交叉脅迫下表現交叉適應性的論證之一。我們觀察到水稻幼苗細胞在高溫脅迫后出現了明顯的損傷，尤以葉綠體結構變化最為突出，其次為細胞形態，基粒片層斷裂是葉綠體受高溫脅迫后的普遍特征，這一變化與水稻受到鹽脅迫后的表現類似，鹽脅迫下的水稻幼苗葉片出現了基粒和基質片層瓦解。與高溫組對比，干旱預處理組的水稻幼苗葉綠體結構相對完整、基粒片層較規整、基粒間連接較穩定，表明葉綠體整體結構穩定是水稻在高溫脅迫下依然保持合適光合作用的關鍵。

4 結 論

本研究通過對干旱-高溫交叉脅迫處理下水稻幼苗葉片葉綠素總量、光合生理參數、葉綠素熒光參數以及葉綠體超微結構變化的分析表明：水稻幼苗在響應干旱-高溫交叉脅迫過程中，通過維持正常的葉綠素含量、穩定的葉肉細胞及亞細胞器結構和適度的氣孔開度，緩解后期高溫對其光合作用能力的破壞，從而減小高溫對水稻幼苗生長的傷害，提高了水稻幼苗的耐熱性。試驗從光合生理響應角度初步探討了水稻交叉適應性可能的機制，但水稻交叉適應性是一個涉及到基因、蛋白質、代謝物等復雜的分子生化調控網絡，其機制還需要從基因組、蛋白組及代謝組等多組學角度更加深入地探究。