60Co-γ輻射紫花苜蓿分化苗對高溫脅迫的生理響應

李 波，劉 暢，馮成龍, 李姍姍， 金姍姍，趙金諾，劉家佑，張君輝, 姜思琦, 石婉瑩

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

溫度是影響植物生長的重要因素，高溫導致植物葉片及根系生長受阻，使植物抗病蟲能力下降，產量降低[1]。紫花苜蓿是世界上種植范圍最廣、經(jīng)濟價值最高的優(yōu)質豆科牧草，但高溫限制了苜蓿(MedicagoSativaL.)種植范圍并影響其鮮草的產量及質量[2]，因此應加快對耐高溫苜蓿新品種或品系的選育。輻射育種是利用物理誘變因子引起作物染色體、基因和細胞質異變，從而獲得性狀改善的方法。輻射育種中60Co-γ輻射是最為有效的方法之一[3]，利用60Co-γ射線能選育出性狀優(yōu)良的牧草新品種，謝新春等[4]研究60Co-γ射線誘導結縷草(ZoysiaJaponicaS.)性狀變異，獲得綜合性狀良好突變株‘80-1’和‘10-1’。輻射處理可以誘發(fā)植物遺傳物質改變，組織培養(yǎng)過程中也能夠產生一些變異，將兩者結合起來進行雙重變異，可以在有限的時間內進行大群體篩選，從而提高輻射誘變的效率[5-6]，但關于此方面的研究鮮見報道。由于體細胞無性系變異的發(fā)生往往沒有方向性, 變異類型繁多, 且劣變機率大于優(yōu)變, 而用于植物育種目標的變異則必須是優(yōu)良性狀[7-8], 因此對變異進行有效的篩選至關重要。采用高溫等環(huán)境處理，獲得抗性愈傷組織或抗性細胞系，然后再生獲得抗性突變株，該方法主要用于抗逆性選育，篩選得到的突變體一般要進行生理生化和分子生物學的鑒定[9-10]，為進一步育種應用奠定基礎。楊曦[11]通過對愈傷組織進行高溫脅迫處理，獲得了茶用菊花(Chrysanthemum) 耐熱變異體，潘林等[12]研究輻射苜蓿愈傷組織對高溫脅迫的生理響應，發(fā)現(xiàn)一定輻射劑量可以提高苜蓿愈傷組織耐高溫能力。

畜牧業(yè)的發(fā)展長期受到飼料供應短缺和對國外依賴度高的制約，因而選育適合高溫地區(qū)生長的優(yōu)質牧草具有重要的應用價值。本研究探究60Co-γ輻射處理和高溫環(huán)境下紫花苜蓿分化苗生理特征，以期為探討苜蓿耐高溫馴化的途徑及運用輻射處理來提高苜蓿耐高溫能力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿種子培養(yǎng)

60Co-γ 射線輻射的龍牧 806 苜蓿(MedicagoSativaL.)種子于 2017 年在中國農業(yè)科學院原子能利用研究所進行輻射處理，將同批次的輻射(輻射劑量為600 Gy和800 Gy，劑量率為15 Gy·min-1)和未輻射苜蓿種子種植在黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院試驗基地，收獲后獲得輻射第二代(M2)和未輻射的苜蓿種子。將以上苜蓿種子用35℃溫水浸泡2 h，播種于育苗盆中(營養(yǎng)土∶珍珠巖=2∶1)，每盆播30粒種子，每個劑量10盆，置于溫室內培養(yǎng)75 d后篩選變異植株，將獲得的高株G3(800 Gy)和G4(600 Gy)的葉片愈傷組織分化組培苗[13]，對照為未輻射苜蓿植株葉片愈傷組織分化組培苗,分別記為G3、G4、CK，見圖1。

圖1 苜蓿分化苗

1.2 高溫脅迫溫度及時間的選擇

將CK分化苗接種于MS基本培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)瓶接種6個單芽莖段，待培養(yǎng)至帶有4～5個莖節(jié)和根系時，將相同數(shù)量的分化苗培養(yǎng)瓶分別置入25、30、35、40、45℃光照周期為12 h/12 h的光照培養(yǎng)箱中，各培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，高溫脅迫結束后統(tǒng)計存活率，確定有效的高溫脅迫溫度和天數(shù)。

將CK、G3和G4分化苗分別在篩選的溫度和天數(shù)下進行高溫脅迫，以未高溫處理的CK、G3和G4分化苗為對照。

1.3 生理生化指標的測定

采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量；可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法測定；Pro 含量采用酸性茚三酮法(Proline，Pro)測定；相對電導率(Relative conductivity，RC) 采用電導法測定; MDA ( Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定；過氧化物酶(Peroxidase，POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；過氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用分光光度法測定；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 活性采用 NBT 光化還原法[14]測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行顯著性分析和相關性分析。對測得數(shù)據(jù)用模糊數(shù)學隸屬度公式進行轉換,隸屬函數(shù)公式為:

U(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數(shù)公式為：

U′(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中,U(Xij),U′(Xij)分別為第i個脅迫處理的j項指標的隸屬值和反隸屬值,Xmin和Xmax分別為j項指標的最小值和最大值。

耐高溫系數(shù)=(不同脅迫處理下平均測定值/對照平均測定值)×100%

權重系數(shù)Wi=Ri/∑R，Wi為i指標的權重系數(shù)，Ri為某一指標的權重，∑R為各指標的總權重。

綜合評價(D)=隸屬函數(shù)值×權重系數(shù)

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和Excel軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析法(ANOVA)比較不同處理間的差異顯著性，P<0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫溫度及時間的確定

CK分化苗在不同溫度處理下，對苜蓿分化苗存活率產生一定的影響。25～35℃分化苗處理1、2、3、4、5 d和6 d的存活率均為100%，40℃高溫脅迫下分化苗處理1、2、3、4 d和5 d的存活率分別為100%、100%、80%、64%和22%，時間再延長分化苗無法存活；在45℃高溫處理1 d存活率極低，2～6 d存活率均為0。根據(jù)40℃處理1～6 d分化苗存活率，繪制存活率與處理時間關系圖(圖2)，依據(jù)回歸方程(y=-25.8x+155.6，R2=0.9854)可知40℃下半致死脅迫天數(shù)為4.09 d，致死脅迫天數(shù)為6.03 d，因此選擇40℃高溫處理1～4 d的分化苗進行生理生化指標測定分析。

圖2 苜蓿分化苗在40℃高溫脅迫下存活率的變化

2.2 輻射和高溫脅迫對苜蓿分化苗滲透調節(jié)物質含量的影響

SP，SS和Pro在細胞質內積累，作為滲透調節(jié)物質可調控植物抗逆能力。高溫對苜蓿分化苗SP、SS和Pro含量影響見圖3，在40℃高溫脅迫下，3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)SP含量均隨高溫脅迫時間延長呈先增后降的變化趨勢，SP和SS含量分別在高溫脅迫2 d和3 d達最大值，CK分化苗Pro含量在高溫脅迫2 d達最大值，G3、G4分化苗在高溫脅迫3 d達最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，SP含量分別為CK的2.49倍和7.32倍，SS含量分別為CK的1.44倍和2.12倍，Pro含量分別為CK的1.55倍和1.32倍，輻射苜蓿分化苗的SP、SS和Pro均高于未輻射苗。

注：圖中不同小寫字母表示各處理在不同脅迫時間下差異顯著(P<0.05), 下同。

在40℃高溫脅迫下，G3和G4分化苗SP含量均高于CK，脅迫3 d分化苗SP含量最高，CK、G3、G4分化苗SP含量較其未脅迫組分別增加了530.78%、235.74%和21.32%(P<0.05)；在高溫脅迫的不同持續(xù)天數(shù)，3組分化苗SS和Pro含量變化無明顯規(guī)律，CK、G3和G4分化苗在高溫脅迫3 d時，SS含量較其未脅迫組分別增加了157.16%、79.21%和61.52%(P<0.05), Pro含量較其未脅迫組分別增加了438.55%、323.64%和356.36%(P<0.05)，SP和SS含量為G4>G3>CK，Pro含量為G3>G4>CK，此脅迫時間下的G3和G4的3種滲透調節(jié)物質均高于CK，說明一定高溫脅迫可增加苜蓿分化苗的SP、SS和Pro。

2.3 輻射和高溫脅迫對苜蓿分化苗膜脂透性的影響

MDA含量和RC高低可以反映植物遭受逆境傷害的程度。高溫對苜蓿分化苗MDA含量和RC影響見圖4，3組苜蓿分化苗的MDA含量和RC均隨高溫脅迫時間延長呈增加的趨勢，在高溫脅迫4 d達到最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下的MDA含量分別為CK的1.07倍和1.19倍，RC為CK的91%和98%，說明一定輻射劑量可增加膜脂氧化和膜透性。

圖4 輻射和高溫脅迫下苜蓿分化苗MDA含量和RC的變化

在40℃高溫脅迫4 d時，CK、G3和G4分化苗的MDA含量較其未脅迫組分別增加了80.86%，36.53%和61.08%(P<0.05), RC較其未脅迫組分別增加了23.75%、25.66%和21.55%(P<0.05), MDA含量為G4>CK>G3，RC含量為CK>G4>G3，表明一定的輻射劑量可以緩解高溫脅迫對苜蓿分化苗細胞膜的損傷。

2.4 輻射和高溫脅迫對苜蓿分化苗抗氧化酶活性的影響

逆境脅迫下抗氧化酶活性高低與植物抗逆性密切相關。高溫對苜蓿分化苗POD和SOD活性的影響見圖5，3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)POD和SOD活性均隨脅迫時間延長呈先增后降趨勢，在40℃高溫脅迫下，CK，G3和G4分化苗POD和SOD活性在高溫脅迫2 d或3 d達最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，POD活性分別為CK的1.19倍和1.68倍，SOD活性分別為CK的56%和82%，輻射苜蓿分化苗的POD和SOD活性均高于未輻射苗。在40℃高溫脅迫3 d時，CK、G3和G4分化苗的POD活性較其未脅迫組分別增加了59.58%、82.87%和130.52%(P<0.05)，SOD活性較其未脅迫組分別增加了114.28%、350.91%和160.00%(P<0.05), 3組分化苗的各脅迫組POD活性為G4>G3>CK，SOD活性變化不一，但一定的輻射劑量可增加苜蓿分化苗的POD和SOD活性。

輻射和高溫對苜蓿分化苗CAT活性的影響見圖5，高溫處理3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)CAT活性均隨脅迫時間的增加呈降低的變化趨勢，在高溫脅迫4 d達最小值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，G3和G4分化苗的CAT活性分別為CK的89%和82%；高溫脅迫4 d時，CK、G3和G4分化苗的CAT活性較其未脅迫組增降低了81.68%、65.57%和69.58%(P<0.05)，3組分化苗各脅迫組的CAT活性變化不一致，高溫脅迫降低了CAT活性，但一定的輻射劑量可增加苜蓿分化苗CAT活性。

圖5 輻射和高溫脅迫下苜蓿分化苗抗氧化酶活性的變化

2.5 高溫脅迫苜蓿分化苗耐熱系數(shù)

耐熱系數(shù)的變化反映了植物在面對高溫環(huán)境時的耐熱能力，3組分化苗耐熱系數(shù)的變化值見表1。與CK相比，高溫脅迫不同時間后的苜蓿分化苗各指標耐熱系數(shù)均發(fā)生不同程度改變，SP、SS、Pro、POD和SOD這5項指標呈先升后降現(xiàn)象，CAT指標呈下降，而MDA和RC呈升高趨勢，表明高溫脅迫下苜?？赏ㄟ^植株自身的生理響應來抵抗逆境。依據(jù)3種苜蓿分化苗各單項指標耐熱系數(shù)的變化幅度，得出各單項指標對高溫脅迫的敏感程度，結果為SP>Pro>SS>POD>SOD>MDA>RC>CAT，表明苜蓿的SP和Pro對高溫脅迫的敏感性較大，CAT較小。

表1 苜蓿分化苗耐熱系數(shù)

2.6 高溫脅迫苜蓿分化苗抗性綜合分析

采用隸屬函數(shù)法和綜合D值法，對3組苜蓿分化苗在高溫脅迫下的生理生化指標變化進行綜合評價(表2)。CK，G3和G4分化苗各項指標的隸屬函數(shù)平均值分別為0.168，0.700和0.668，各項指標的綜合D值分別為0.219，0.694和0.669，3組分化苗的抗性綜合評價由大到小依次為G3>G4>CK，輻射可提高苜蓿分化苗的耐熱能力，其中G3分化苗抗性最高。

表2 苜蓿分化苗8項指標的隸屬函數(shù)值

3 討 論

植物在生長發(fā)育過程中難免遭遇各種逆境脅迫，隨著全球氣候變暖，極端溫度日益增加，對植物生長發(fā)育造成不利影響。培育抗逆境脅迫牧草品種是牧草抗逆育種研究的重要方向。組織培養(yǎng)技術結合輻射誘變進行育種，可增加后代選擇機會，縮短牧草育種周期[15]，從植物細胞中篩選出抗逆境強的突變體，現(xiàn)已成為植物品種改良和新品種選育的新途徑。對于輻射后代苜蓿愈傷組織分化苗而言，研究高溫脅迫下分化苗生理生化指標的變化，有助于了解輻射和高溫雙重作用后苜蓿分化苗的生理損傷機制。

為適應復雜多變的環(huán)境，植物在滲透調節(jié)物質上發(fā)生與之相應的改變來適應環(huán)境，一定輻射劑量和高溫逆境脅迫下植物葉片可積累SP、SS和 Pro等滲透調節(jié)物質，通過提高細胞滲透壓來維持細胞的持水力和水分代謝平衡[16-17]，減輕輻射和高溫脅迫對植物的傷害。已有研究表明，輻射處理多花野牡丹(MelastomaaffineL.)種子幼苗SP和SS隨著輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢[18]，高溫脅迫導致羊棲菜(SargassumfusiformeO.)細胞內積累了SP、SS和Pro等滲透調節(jié)物質[19]，說明在適宜輻射劑量和高溫下依然可以維持一定的正常代謝，這與本研究中所篩選的獲得輻射的G3和G4苜蓿分化苗和高溫脅迫苜蓿分化苗積累更多的3種調節(jié)物質的研究結果一致，且輻射可促進高溫脅迫的G3和G4分化苗SS、SP和Pro的積累，與韓亞楠[20]研究60Co-γ輻射對鹽脅迫下烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisF.)耐鹽性的影響中合成脯氨酸方式減少離子毒害的研究結果相似。

輻射和高溫超過植物的耐受能力后，會使其膜系統(tǒng)受到傷害，電解質從細胞內滲出，引起組織浸出液電解質濃度增加，反映在相對電導率升高、植物膜系統(tǒng)受損，還可造成膜脂過氧化，MDA是膜脂過氧化作用的產物[21]，其含量增加是膜脂過氧化的表現(xiàn)，因此RC和MDA含量高低可衡量細胞膜損傷程度，與植物的抗逆性呈負相關。張秀梅等[22]通過60Co-γ輻射對洋竹草(CallisiarepensJacqL.)生理影響的研究表明，輻射提高了各處理MDA含量和RC，MDA含量及RC呈不斷升高的趨勢，且在 38℃高溫脅迫 15 d 時達到最大值，這與本研究中所獲得的輻射G3和G4苜蓿分化苗和高溫脅迫苜蓿分化苗的MDA和 RC的增加研究結果一致，且輻射和高溫雙重作用下，G3和G4分化苗的MDA和 RC增加。鄭鳳霞[23]研究低劑量60Co-γ輻照對擬南芥幼苗耐熱性的影響，在40℃ 6 h熱脅迫下，50 Gy60Co-γ輻射的擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)幼苗中MDA明顯低于CK，進一步證明低劑量的60Co-γ輻射能夠減輕熱脅迫對植物造成的損傷，與本研究中800 Gy輻射劑量下的高溫脅迫可降低對苜蓿分化苗的細胞膜氧化損傷研究結果一致。

POD、SOD和CAT是植物細胞內清除活性氧的重要保護酶，在輻射和高溫一定限度內，保護酶可誘導生理反應，使植物避免活性氧自由基對自身的傷害[23-24]。已有研究表明，60Co-γ射線對露地菊(Dendranthema×grandifloraGround-growChrysanthemum)品種輻射誘變效應[25]中，SOD和CAT活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，POD活性隨輻射劑量增加呈現(xiàn)出上升的趨勢，高溫脅迫對絲瓜(LuffacylindricaR.)幼苗抗氧化酶活性研究中[26]，隨高溫脅迫時間的延長，SOD、POD和CAT活性均呈先升后降的趨勢，SOD和POD活性均在脅迫3 d時達到峰值，CAT活性在脅迫1 d時達到峰值，本試驗中高溫使苜蓿分化苗正常的氧代謝受到干擾，逆境初期POD 和SOD活性升高，表現(xiàn)為保護效應CAT 降低，隨著脅迫時間的延長，POD、CAT和SOD活性逐漸降低，使自由基積累和MDA 含量顯著增加，細胞膜系統(tǒng)損傷，加重了苜蓿分化苗傷害。鄭鳳霞[23]研究低劑量60Co-γ輻照對擬南芥幼苗耐熱性的影響，在40℃、6 d熱脅迫下50 Gy60Co-γ輻射的擬南芥幼苗中SOD、POD和CAT的活性明顯高于CK，表明了低劑量的60Co-γ輻射能夠增強植物的抗氧化酶活性，與本研究中一定輻射劑量苜蓿分化苗在40℃、4 d熱脅迫下SOD和POD的活性變化結果一致，而與CAT的活性變化存在差異。

4 結 論

對苜蓿分化苗進行高溫脅迫和分化苗存活率及生理生化指標變化分析，綜合評價輻射分化苗對高溫脅迫抗性。依據(jù)高溫對苜蓿分化苗存活率影響，確定模擬高溫脅迫進程為40℃、4 d；高溫脅迫對CK、G3和G4分化苗的滲透調節(jié)物質、膜脂透性和抗氧化酶活性產生不同影響。對8項生理生化指標的綜合分析表明，G4平均隸屬函數(shù)值和綜合D值最高，分別為0.793和0.852，3組分化苗耐高溫能力排序為G4>G3>CK，說明一定輻射劑量可以提高苜蓿分化苗的抗性。