干細(xì)胞治療新冠肺炎的研究進(jìn)展

蔣素妹 王正霞 吉寧飛 黃茂

作者單位：1. 210029 江蘇 南京，南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(江蘇省人民醫(yī)院)呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 2. 225300 江蘇 南京，南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院急診科

新冠肺炎(Corona Virus Disease-19,COVID-19)正在全球大流行，給世界文明發(fā)展帶來了前所未有的巨大沖擊，疫情肆虐，迄今為止卻仍未有明確的臨床治療策略。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSCs)因具備免疫調(diào)節(jié)能力和再生特性，受到醫(yī)學(xué)界的青睞，目前干細(xì)胞治療已進(jìn)入多個臨床試驗階段。本文對干細(xì)胞治療新冠肺炎的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為臨床研究提供參考。

治療現(xiàn)狀

COVID-19重癥病例與嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)和中東呼吸綜合征相似。致病病毒與SARS-Cov高度同源，故而稱之為SARS-Cov-2[1]，具有高傳染性和高致病性。目前的治療策略包括非特異性抗病毒藥物(雷米西韋等)、恢復(fù)期血漿、糖皮質(zhì)激素、羥氯喹、靶向免疫調(diào)節(jié)藥(妥西單抗等)以及中藥[2-4]。雖然有數(shù)據(jù)表明地塞米松能夠降低氧療患者的28天死亡率，雷米西韋可以縮短輕癥患者的康復(fù)時間[5]，但在治療重癥感染時，這些藥物尚缺乏足夠證據(jù)支持，能夠降低死亡率[6]。

發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞因子風(fēng)暴

COVID-19的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-Cov-2可以通過表面的S蛋白特異性識別并結(jié)合細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體，進(jìn)而侵入宿主細(xì)胞，這與2003的SARS-Cov 類似[7-8]。ACE2受體廣泛分布于人體多個器官組織，包括肺、心血管、肝臟、腎臟和胃腸道[9]。其實，幾乎所有的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞都表達(dá)ACE2，因此一旦病毒進(jìn)入血液循環(huán)，所有表達(dá)ACE2的組織器官都有可能成為SARS-Cov-2和免疫細(xì)胞的戰(zhàn)場。這就解釋了為什么除了急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)之外，重癥COVID-19患者還會并發(fā)急性心肌損傷、急性腎損傷、休克和多器官功能障礙綜合征(multiple-organ dysfunction syndrome，MODS)[10]。

重癥COVID-19發(fā)病與病毒入侵驅(qū)動宿主產(chǎn)生過度免疫反應(yīng)有關(guān)。當(dāng)免疫系統(tǒng)被過度激活以試圖殺死病毒時，會形成大量炎癥因子，產(chǎn)生病理性免疫反應(yīng)，稱之為“細(xì)胞因子風(fēng)暴”[11]。過度或失控的免疫反應(yīng)與進(jìn)展迅速的細(xì)胞因子風(fēng)暴在SARS-Cov-2感染引起的ARDS和MODS 的發(fā)病機(jī)制中起著主要作用。研究顯示[7]，ICU患者相比于非ICU患者，炎癥因子如白細(xì)胞介素-2(IL-2)、IL-7、集落刺激因子(CSFs)、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等顯著增加。。

干細(xì)胞

一、干細(xì)胞分類

干細(xì)胞是一類具有免疫調(diào)節(jié)、再生能力和分化特性的特殊細(xì)胞，分化后的子代細(xì)胞，維持局部組織穩(wěn)態(tài)同時還具有與非分化細(xì)胞相同的功能[14]。鑒于此，研究人員設(shè)法將之應(yīng)用到臨床治療中，以促進(jìn)損傷組織的修復(fù)。干細(xì)胞根據(jù)來源不同分為兩種類型：胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)分化的潛能又分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞、(成體)多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞[4]。其中利用人類的多能干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells ,ESCs)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)已用來培養(yǎng)3D腦器官模型、治療脊髓損傷、 ARDS和膿毒癥[15]。然而ESCs起源于胚胎，存在無法忽視的倫理問題，iPSCs雖然通過自體的方式獲得，避免相關(guān)的免疫排斥問題，但能無限期生長，存在較高的致瘤風(fēng)險[15]。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是研究最廣的一類干細(xì)胞，有多個組織來源，包括骨髓、臍帶血、脂肪、皮膚、胎盤、羊水、牙髓和毛囊。不同于ESCs的完全可塑性，MSCs具有較高的可塑性，可分化為多種細(xì)胞系。MSCs有多種優(yōu)勢，易于分離，具有較高的體外擴(kuò)張潛力和較低的免疫原性，利于同種異體間移植[15]。此外，它們可以通過自體獲得，減少了免疫排斥問題，且使用時幾乎不涉及倫理問題。

MSCs已在動物模型中應(yīng)用于脊髓損傷、骨關(guān)節(jié)炎、心肌梗死、肝病、自身免疫性疾病和造血缺陷等不同疾病的治療。移植MSCs可顯著恢復(fù)心肌梗死后心功能，降低死亡率，促進(jìn)大鼠肝損傷后細(xì)胞的再生[16]。在小鼠博來霉素誘導(dǎo)的肺損傷模型中，MSCs降低了博來霉素引起的肺組織炎癥和膠原沉積[17]。

干細(xì)胞能夠發(fā)揮組織修復(fù)作用，一方面源于其有多向分化潛能和歸巢能力，它們可以主動遷移到損傷部位，并分化為局部成分，基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1)/CXC趨化因子受體4(CXCR4)軸是MSCs歸巢的關(guān)鍵[18-19]。 研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈輸注后會自行聚集到肺，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，保護(hù)肺泡上皮細(xì)胞，恢復(fù)肺微環(huán)境，預(yù)防肺纖維化，改善肺功能[20]；另一方面，MSCs通過旁分泌途徑釋放多種可溶性細(xì)胞因子，其中最具特征的是外泌體(exosome)，諸多研究證實MSCs的修復(fù)功能與其釋放的外泌體密切相關(guān)。Khatri等人在流感病毒的豬模型中使用MSCs衍生囊泡(MSC-EVs)，發(fā)現(xiàn)病毒在肺中的復(fù)制、促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和病毒引起的肺損傷均明顯減少[21]。Zhu等人在研究誘發(fā)性肺損傷時觀察到應(yīng)用人MSC-EVs可減少肺水腫和中性粒細(xì)胞計數(shù)，增加角質(zhì)細(xì)胞增長因子的表達(dá)[22]；三是與免疫細(xì)胞直接作用，或與宿主細(xì)胞發(fā)生基因融合發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[23]。此外，基因研究[24]顯示MSCs不表達(dá)ACE2和Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶，提示MSCs對SARS-Cov-2天然免疫，MSCs低表達(dá)或不表達(dá)HLA，這種低免疫原性，能夠使其逃避宿主的免疫反應(yīng)，是其發(fā)揮治療作用的重要基礎(chǔ)[25]。

MSCs已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療和組織工程中。在治療皮質(zhì)醇耐藥的免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病中，如移植物抗宿主病(GVHD)[26]，MSCs顯示出良好療效，且無嚴(yán)重不良反應(yīng)。對MSCs治療研究的系統(tǒng)性回顧和Meta分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)熱的風(fēng)險增加，但沒有急性輸注毒性、感染、血栓/栓塞事件或惡性腫瘤等不良反應(yīng)[27]。

三、LIFNano

此外，MSCs 釋放的白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)可對抗病毒性肺炎期間的細(xì)胞因子風(fēng)暴[28]，但可能表達(dá)不夠，不足以對抗疾病的破壞。帶有“LIFNano”的合成干細(xì)胞作為一種創(chuàng)新的技術(shù)選擇，比不使用納米技術(shù)增加了1000倍的效能，或許能夠滿足當(dāng)下疫情對大量藥物的需求，有利于抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴[29]。

四、干細(xì)胞治療新冠的臨床試驗

MSCs作為一種治療方法，在呼吸系統(tǒng)疾病動物模型中已得到了充分體現(xiàn)，研究相對較多的包括ARDS、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌、肺炎和特發(fā)性肺纖維化。部分已進(jìn)入臨床I/ II期試驗。新冠肺炎暴發(fā)后，干細(xì)胞的治療再次受到醫(yī)學(xué)研究人員的廣泛關(guān)注，多個小規(guī)模臨床試驗相繼展開。

北京佑安醫(yī)院給7例COVID-19肺炎患者單次靜脈注射MSCs后發(fā)現(xiàn)，MSCs的免疫調(diào)節(jié)療效顯著，重癥患者的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞顯著增加[24, 30]。

由于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs)相對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞更易獲得，且可以在實驗室中快速有效地擴(kuò)增[30]。Meng等[31]研究發(fā)現(xiàn)中重度COVID-19患者接受UC-MSCs治療后，需要機(jī)械通氣和呼吸困難的病例數(shù)減少，血清IL-6水平下降，4例重癥患者中，IL-6水平最高者下降最大，氧合指數(shù)改善最顯著，提示炎癥細(xì)胞因子高的患者更有可能受益于UC-MSCs治療。

Shu等[32]的臨床試驗中治療組CRP和IL-6水平明顯降低，CT顯像對肺部炎癥的吸收明顯短于對照組。研究同時意外發(fā)現(xiàn)一個有趣現(xiàn)象，合并糖尿病的COVID-19患者在移植UC-MCS后使用胰島素的次數(shù)減少。因為糖尿病是COVID-19患者死亡的獨立危險因素[33]，對于此類患者，UC-MCS移植或許是最適合的治療措施。

Feng等人[34]開展了一項前瞻性隊列隨訪研究，28例嚴(yán)重COVID-19患者隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)治療組(對照組)和標(biāo)準(zhǔn)治療加hUC-MSC組，隨訪三個月后，兩組血常規(guī)、C反應(yīng)蛋白和降鈣素、肝腎功能、凝血、心電圖、腫瘤標(biāo)記物、視力，幾乎都在正常范圍內(nèi)，而且hUC-MSC組平均FEV1、FEV1/FVC更高，圣喬治評分更低。研究顯示靜脈移植hUC-MSC可部分促進(jìn)肺功能的恢復(fù)，改善健康相關(guān)生活質(zhì)量(HRQL)。

截至目前全球基于MSCs的COVID-19治療的臨床試驗已逾300多個，已完成的有38個(http://www.chictr.org.cn；https://clinicaltrials.gov)。一項在中國60名嚴(yán)重COVID-19中進(jìn)行的前瞻性、雙盲、多中心隨機(jī)試驗(NCT04288102)，以評估靜脈注射UC-MSCs的療效和安全性。目前該臨床試驗處于第2階段。另一項在美國進(jìn)行的12例小規(guī)模的臨床試驗(NCT04355728)，旨在了解hUC-MSCS治療有急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)嚴(yán)重并發(fā)癥的COVID-19患者的安全性和有效性。其余都尚未招募或處于招募中，多個國家的醫(yī)生和研究人員正致力于此研究，這些正在進(jìn)行的臨床試驗為對抗COVID-19提供了重要的信息。

諸多研究表明MSCs或其外泌體(MSCs-exo)都可減輕不同類型肺損傷引起的肺部炎癥和病理損害，猜測MSCs的抗炎及免疫調(diào)節(jié)或許是通過MSC外泌體作用。雖然目前為止沒有發(fā)生MSCs相關(guān)的嚴(yán)重不良事件，但仍有學(xué)者認(rèn)為靜脈注射MSCs可能損傷微循環(huán)，并具有致突變性和致癌性的風(fēng)險，而霧化吸入MSC衍生的外泌體卻可以規(guī)避這樣的風(fēng)險。鑒于此，上海瑞金醫(yī)院率先開展了吸入MSCs-exo治療嚴(yán)重COVID-19的I期臨床試驗(ClinicalTrials.gov, Identifier:NCT04276987)，以評估其安全性和有效性。最新一項針對COVID-19相關(guān)ARDS患者進(jìn)行擴(kuò)展訪問協(xié)議(NCT04657458)正在展開，采用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生細(xì)胞外囊泡(ExoFlo)輸注，或許能為重癥COVID-19患者帶來福音。而且與MSCs相比，MSCs-exo的另一個優(yōu)點是儲存時間較久，長達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月，可以在-80℃不使用二甲基亞砜而保持生物活性[35]，更利于運輸和遠(yuǎn)距離使用。

展 望

MSCs 相關(guān)的細(xì)胞療法在臨床前數(shù)據(jù)中顯示出較好的療效，可以用于臨床。對于 COVID-19 研究，預(yù)防細(xì)胞因子風(fēng)暴可能是治療新冠肺炎的重要節(jié)點。在高水平炎癥因子患者中，及時的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)可能防止疾病進(jìn)展到ARDS，并避免了侵入性通氣。免疫調(diào)節(jié)的理想機(jī)會窗口，可能是在患者發(fā)生疾病加重和需要有創(chuàng)機(jī)械通氣(插管)之前[36]。一旦病人需要氣管插管，干預(yù)窗口期可能已經(jīng)錯過。所以，臨床上迫切需要探尋與疾病的病理生理學(xué)密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，來預(yù)測不良結(jié)局并深入描述不同疾病階段宿主的免疫反應(yīng)，為免疫調(diào)節(jié)劑對抗病毒反應(yīng)提供治療靶點。

干細(xì)胞的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用在諸多臨床前及臨床研究中，均得到了證實，干細(xì)胞能夠分化為不同的組織細(xì)胞類型為其不同組織器官的修復(fù)提供了理論依據(jù)。到目前為止，無論是臨床前研究還是早期臨床試驗，都尚未發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞相關(guān)的致癌、致畸及其他不良事件，為將來的臨床醫(yī)學(xué)提供了巨大的保障，也使其成為治療重癥COVID-19的有力候選者。

與之相比，干細(xì)胞衍生的微泡或外泌體具備多種優(yōu)勢，它們在急性炎癥性肺疾病的臨床前研究主顯示出與其母細(xì)胞幾乎等效的抗炎和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，因為不需要分化和自我復(fù)制，降低了醫(yī)源性腫瘤形成的風(fēng)險；可以在-80℃不需要二甲基亞砜儲存仍能保持生物活性；它們不表達(dá)MHCI或II抗原，也不能誘導(dǎo)其表達(dá)，允許異基因移植[35]。這些不受倫理限制、高可用性和易于保存等等優(yōu)點，使其在臨床中擁有廣泛的應(yīng)用前景。

COVID-19疫情的暴發(fā)，使得全球的研究人員齊心協(xié)力，聯(lián)手抗擊疫情，許多臨床試驗相繼開展，重點是MSCs，而且仍然需要大樣本的隨機(jī)對照試驗以減少偏差。目前我國針對SARS-Cov-2的疫苗已在群眾中推廣，特效抗病毒藥物尚在研發(fā)中，藥物治療似乎仍然不足，干細(xì)胞治療可能成為重癥患者的福音。