新型冠狀病毒變異譜系的研究進展

顧望 于世寰

作者單位：150001 黑龍江 哈爾濱，哈爾濱醫科大學附屬第一醫院呼吸內科

新型冠狀病毒肺炎(新冠肺炎，COVID19)是由新型冠狀病毒(2019-nCoV)感染引發的急性呼吸道傳染病，目前已成為全球性重大的公共衛生事件，截至2021年8月25日，世界衛生組織報告了213050725例新冠肺炎確診病例，其中包括44483528例死亡病例[1]。 隨著新型冠狀病毒的全球傳播，導致全球范圍內大量新型冠狀病毒變異譜系出現,一起譜系的出現引發了廣泛的擔憂，如B.1.1.7(Alpha)譜系、B.1.351(Beta)譜系、P.1(Gamma)譜系、B.1.167.2(Delta)譜系、B.1.429(Epsilon)譜系、B.1.526(Iota)譜系。新型冠狀病毒通過刺突蛋白感染靶細胞，刺突蛋白是抗體的主要靶點，新的病毒譜系在刺突蛋白的突變使得新型冠狀病毒傳播性增強、疾病嚴重程度增加以及產生免疫逃避，同時對目前已有一些治療手段產生重要的影響。本文將對新型冠狀病毒變異譜系的研究進展進行綜述。

新型冠狀病毒及變異譜系的結構

一、新型冠狀病毒的結構

新型冠狀病毒屬于β屬的冠狀病毒，由刺突蛋白(S)、核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基質蛋白(M)和核糖核酸組成[2]。冠狀病毒的刺突蛋白是一種同源三聚體，每個單體包括一個S1亞單位和一個S2亞單位，S1亞單位包含受體結合區(Receptor Bin-ding Domain, RBD)、N末端結構域(N-terminal domain NTD)及兩個C末端結構域(C-terminal domains CTDs)。RBD與受體血管緊張素轉換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)結合，S2亞單位介導膜融合[3-4]。

二、新型冠狀病毒感染宿主細胞過程

新型冠狀病毒通過刺突蛋白感染靶細胞，刺突蛋白首先作為單鏈前體被合成，然后被furin樣蛋白酶加工成受體識別片段S1和融合片段S2[5]。在S1的RBD與ACE2結合的同時S2被另一種蛋白酶進行第二次水解切割，這導致S1的解離和S2不可逆的重折疊成融合后狀態，最終導致膜融合[6-7]。在這個過程中，依賴絲氨酸蛋白酶TMPRSS2啟動刺突蛋白[8]，神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1，NRP1)可以促進刺突蛋白與ACE2的相互作用來增強感染性[9]。

三、新型冠狀病毒變異譜系的刺突蛋白突變

新型冠狀病毒的全球傳播導致全球范圍內大量病毒譜系的出現。新型冠狀病毒首先出現的突變是刺突蛋白614位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D614G)，這種突變防止刺突蛋白三聚體過早的解離，有效的增加了功能性S蛋白數量，并調節了膜融合結構重排[10]。D614G突變使得新型冠狀病毒的傳染性和穩定性增強，感染D614G突變體的新冠肺炎患者上呼吸道病毒載量增高，增加了傳播能力，但是與疾病的嚴重程度無關[11-12]。隨著新冠肺炎大流行的蔓延，D614G突變更加普遍,到2020年6月，超過74%的已公布序列出現D614G突變。

B.1.1.7譜系是2020年9月在英國首次發現變體，除了在刺突蛋白上具有D614G突變外，B.1.1.7譜系在刺突蛋白RBD結合位點中第501位氨基酸由絡氨酸取代天冬酰胺(N501Y),在NTD中69位組氨酸、70位纈氨酸、144位酪氨酸缺失，B.1.1.7譜系在刺突蛋白中還存在其他突變，刺突蛋白中570位氨基酸由天冬氨酸取代丙氨酸(A570D)、第681位氨基酸由組氨酸取代脯氨酸(P681H)、第716位氨基酸由異亮氨酸取代蘇氨酸(T716I)、第982位氨基酸由天冬氨酸取代絲氨酸(S982A)、第1118位氨基酸由組氨酸取代天冬氨酸(D1118H)。但是B.1.1.7譜系在RBD和NTD中的突變沒有引起重大的結構重組。其中N501Y突變使得RBD與ACE2的親和力增加，無論ACE2寡聚狀態如何。A570D、S982A突變使得RBD更好的呈現受體結合序列至ACE2，增強的受體序列呈現和親和力增加可能允許B.1.1.7譜系感染比鼻和支氣管上皮細胞更低ACE2水平的細胞，擴大的細胞趨向性可能是患者死亡風險增加的原因，B.1.1.7譜系不僅更容易傳播，還能導致更嚴重感染[13-15]。而在NTD上的第144位氨基酸的丟失雖然沒有引起重大結構重排，卻導致對大部分抗NTD的單克隆抗體產生耐藥性[16]。

B.1.351譜系首次發現于南非，在刺突蛋白中除了D614G突變，B.1.351譜系在RBD中第417位氨基酸由天冬酰胺取代了賴氨酸(K417N)、第484位氨基酸由賴氨酸取代了谷氨酸(E484K)、N501Y。在NTD中第18位氨基酸由苯丙氨酸取代亮氨酸(L18F)、第80位氨基酸由丙氨酸取代天冬氨酸(D80A)、第215位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D215G)，同時在刺突蛋白中還存在第242位亮氨酸、第243位丙氨酸、第244位亮氨酸的丟失[17]。B.1.351譜系刺突蛋白對單體ACE2的親和力更高，對二聚體ACE2的親和力稍低。B.1.1.7譜系RBD中N501Y突變增強了受體識別，但是B.1.351譜系的額外K417N突變和E484K突變使得RBD與ACE2結合力降低到與D614G變體相同水平,對ACE2親和力低于B.1.1.7譜系。B.1.351譜系RBD中的突變并未引起主要結構的變化，但是E484K和K417N突變產生了免疫逃避，有助于抵抗針對RBD的單克隆抗體的中和，NTD中的中L18F突變以及第242位亮氨酸、第243位丙氨酸、第244位亮氨酸的丟失引起NTD抗原表位的重排，大大降低了針對NTD單克隆抗體的效力[14-16,18]。

P.1譜系由B.1.1.28譜系分支而來，B.1.1.28譜系首次發現于巴西，與B.1.351譜系共享了K417N、E484K、N501Y突變，P.1譜系RBD中第417位氨基酸由蘇氨酸取代了賴氨酸(K417T)，同時保留了E484K、N501Y突變。P.1譜系在NTD中存在L18F突變、第20位氨基酸由天冬酰胺取代蘇氨酸(T20N)、第26位氨基酸由絲氨酸取代脯氨酸(P26S)、第138位氨基酸由酪氨酸取代天冬氨酸(D138Y)、第190位氨基酸由絲氨酸取代精氨酸(R190S)突變。P.1譜系在與ACE2親和力方面與B.1.351譜系相似，同時也抵抗針對RBD及NTD的單克隆抗體的中和。

B.1.167譜系首次在印度被報道，但已經全球傳播，其中B.1.167.2譜系備受關注，在2020年12月在印度首次被檢測到。B.1.167.2譜系同樣存在D614G突變，此外在刺突蛋白中RBD中存在第452位氨基酸由精氨酸取代亮氨酸(L452R)、第478位氨基酸由賴氨酸取代蘇氨酸(T478K)，在NTD中第19位氨基酸由精氨酸取代蘇氨酸(T19R)、第142位氨基酸由天冬氨酸取代甘氨酸(G142D)、第156位和157位氨基酸缺失、第152位氨基酸由甘氨酸取代精氨酸(R158G)。其中L452R突變與B.1.167.2譜系傳染性增加相關，同時降低了恢復期血漿及特異性單克隆抗體的中和作用,L452R突變在B.1.427/B.1.429譜系中被發現[19]。

B.1.429譜系首次發現于美國，B.1.429譜系刺突蛋白RBD中存在L452R突變、NTD中第13位氨基酸由異亮氨酸取代絲氨酸(S13I)、第152位氨基酸由半胱氨酸取代色氨酸(W152C)。L452R突變同樣使得B.1.429譜系的傳染性增加，同時降低針對RBD單克隆抗體的中和作用。B.1.429譜系的S13I、W152C突變使得針對NTD的活性降低，但是并沒有使得傳染性增加[19-20]。

B.1.526譜系在2021年初的感染率迅速上升，其在刺突蛋白上存在E484K突變，B.1.526譜系的子譜系B.1.526.1存在L452R突變，子譜系B.1.526.2在刺突蛋白上第477位氨基酸由天冬酰胺取代絲氨酸(S477N)。B.1.526譜系和B.1.526.2譜系刺突蛋白共同存在第5位氨基酸由苯丙氨酸取代亮氨酸(L5F)、第95位氨基酸由異亮氨酸取代蘇氨酸(T95I)、第253位氨基酸由甘氨酸取代天冬氨酸(D253G)、D614G、第701位氨基酸纈氨酸取代丙氨酸(A701V)或第957位氨基酸由精氨酸取代谷氨酰胺(Q957R)。S477N突變并沒有引起抗RBD單克隆抗體、恢復期血漿、疫苗血清的中和活性的變化[21-22]。

新型冠狀病毒變異譜系對治療的影響

一、恢復期血漿

新冠肺炎康復患者的恢復期血漿作為被動免疫轉移的一種方法，有望成為治療新冠肺炎的重要手段，并且在臨床實驗外被廣泛使用。恢復期血漿中免疫球蛋白IgG大部分通過與S2亞單位、NTD結合起到中和新型冠狀病毒的作用，小部分通過與RBD結合中和新型冠狀病毒[23]。不同的新型冠狀病毒譜系在刺突蛋白中獲得的突變，使得病毒對于恢復期血漿產生了免疫逃避。早期感染新型冠狀病毒的患者的恢復期血漿對于野生型新冠病毒有著中和活性，同時也對B.1.1.7譜系保持了中和活性，但是對于B.1.351譜系的中和活性出現了顯著的降低[16]。即使恢復期血漿對于野生型病毒、B.1.1.7譜系保持中和活性，但是在一項隨機、對照、開放的臨床實驗中，RECOVERY協作組發現對于重型新冠肺炎患者接受恢復期血漿治療并不能降低28天死亡率、出院時間[24]。一項發表于新英格蘭雜志的研究結果與RECOVERY協作組相一致，同時觀察到，在未接受機械通氣新冠肺炎患者中，輸注抗體水平高的血漿的患者死亡風險比輸注抗體水平低的血漿患者的死亡風險更低，但是在該研究中并沒有考慮到新的病毒變體的影響[25]。對于B.1.167.2譜系和B.1.429譜系，與B.1.351譜系類似，恢復期血漿的中和活性同樣出現下降[26]。但是，恢復期血漿對于新的病毒變體的效果仍缺乏臨床實驗佐證。

二、抗新型冠狀病毒單克隆抗體

新冠肺炎的大流行已在全球產生廣泛影響，需要制定有效的干預措施來結束這一流行病，使用單克隆抗體的單一和聯合療法已獲得緊急使用授權。單克隆抗體得針對得主要靶點是RBD和NTD，但是新的病毒變體在刺突蛋白上的突變引發了人們對單克隆抗體療效的擔憂。LY-CoV555、LY-CoV016、REGN10933、REGN10987這四種單克隆抗體獲得臨床批準，其目標靶點是RBD。對于B.1.1.7譜系，LY-CoV555失去了抗病毒活性，LY-CoV016、REGN10933、REGN10987仍保持活性。對于B.1.351譜系，LY-CoV555單獨或與LY-CoV016組合對于B.1.351譜系無活性，REGN1933中和活性受損,但是REGN10933和REGN10987的組合保留大部分中和活性。這四種抗RBD單克隆抗體對于B.1.167.2譜系的效果與對B.1.1.7譜系類似。對于B.1.429譜系，LY-CoV016顯示中和活性的降低，LY-CoV555完全失去中和活性，而REGN1933和REGN10987組合的中和活性不受影響[20,27-28]。

三、新型冠狀病毒疫苗

新型冠狀病毒疫苗通過誘導特異性抗體的產生，從而達到抵抗病毒保護機體的作用，可用于預防感染或降低疾病嚴重程度。疫苗正在被廣泛接種，但是新的病毒譜系在不斷出現。來自接種個體的血清對于B.1.1.7譜系的中和活性基本完整，但是對于B.1.351譜系，其中和活性損失較大,接受兩劑BNT162b2疫苗對B.1.351譜系的有效性為75%，接種兩劑ChAdOx1 nCoV-19疫苗對于B.1.351譜系，在預防輕度至中度新冠肺炎方面沒有效果,同樣mRNA-1273疫苗誘導的血漿抗體對于B.1.351譜系的中和效力也明顯下降[16,29-32]。對于B.1.167.2譜系，接種兩劑BNT162b2疫苗的有效性約為88%，接種兩劑ChAdOx1 nCoV-19疫苗的有效性約為67%[33]。對于B.1.429譜系，有實驗表明，相較于D614突變體，BNT162b2疫苗誘導的血漿抗體的平均中和效力下降2.3倍，mRNA-1273疫苗誘導的血漿抗體的平均中和效力下降下降2.4倍[20]。

討 論

新型冠狀病毒在全球范圍內大流行，每天大量的復制事件使得新的病毒譜系的出現不可避免，并大大增加了病毒的遺傳多樣性。對于不斷出現的新的病毒譜系，進行基因序列監測相當重要，還需要理解變異病毒譜系產生免疫逃避的結構基礎。同時新型冠狀病毒變異譜系使得目前治療手段應接不暇，這可能要求我們研發的單克隆抗體及疫苗需要針對新型冠狀病毒更加穩定的靶點。