沉默circ_0081143調(diào)控miR-296-5p抑制腎癌細(xì)胞786-O發(fā)生的作用研究*

鄧春燕,熊蓓蓓,彭 玲,徐敬根

(四川省成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院腫瘤科 610200)

腎癌是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,易轉(zhuǎn)移,轉(zhuǎn)移性腎癌占初診腎癌的20%～30%,迫切需要尋找新的靶點(diǎn)來診斷和治療腎癌[1-2]。miRNA具有原癌基因或抑癌基因的作用,參與多種細(xì)胞生物學(xué)過程；circRNA可競(jìng)爭性吸附miRNA,作為miRNA海綿參與多種基因的表達(dá)調(diào)控,在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[3-4]。研究報(bào)道circ_001895通過調(diào)控miR-296-5p/SOX12促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌進(jìn)展[5]。此外miR-296-5p可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[6]。敲除circ_0000512通過調(diào)節(jié)miR-296-5p/RUNX1軸抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡[7]。Circular RNA Interactome生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-296-5p與circ_0081143有結(jié)合位點(diǎn)。circ_0081143是由COL1A2剪切而成的circRNA,位于chr7:94044537-94055169；研究報(bào)道circ_0081143在胃癌組織中上調(diào),circ_0081143沉默抑制了胃癌發(fā)生并增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性[8]。circCOL1A2沉默通過增強(qiáng)miR-29b的表達(dá)來抑制高糖誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、血管生成[9]。而circ_0081143對(duì)腎癌細(xì)胞786-O生物學(xué)過程的影響尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0081143對(duì)腎癌細(xì)胞786-O生物學(xué)過程的影響及其機(jī)制是否與miR-296-5p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取本院2017年1月至2021年1月37例腎透明細(xì)胞癌患者術(shù)中切除的腎癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織,標(biāo)本均經(jīng)病理檢查確診,患者年齡23～72歲,平均(56.1±5.3)歲。患者術(shù)前未進(jìn)行過放化療,且對(duì)本研究均知情同意。

1.2 細(xì)胞與試劑材料

腎癌細(xì)胞786-O購自上海啟達(dá)生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購自武漢益普生物科技有限公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；MTT試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購自上海恒斐生物科技有限公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自艾美捷科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞處理與分組

腎癌細(xì)胞786-O常規(guī)培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中,將circ_0081143小干擾RNA1、2、3轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后檢測(cè)circ_0081143表達(dá)水平,選擇表達(dá)水平最低的小干擾RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

將circ_0081143小干擾RNA及陰性對(duì)照、miR-296-5p模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞,記為si-circ_0081143 組、si-NC組、miR-296-5p mimic組、miR-NC組；將circ_0081143小干擾RNA與miR-296-5p抑制劑共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞,記為si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor組。

1.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0081143和miR-296-5p的表達(dá)水平

提取腎癌組織、癌旁組織及各組786-O細(xì)胞的總RNA,合成cDNA,按照試劑盒說明進(jìn)行PCR,相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。以GAPDH和U6為內(nèi)參,circ_0081143上游引物序列：5′-GCAGGAGGTTTCGGCTAAGT-3′,下游引物序列：5′-GCAACAAAGTCCGCGTATCC-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CCTCAAGATCATCAGCAATGCCTC-3′,下游引物序列：5′-GTGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′；miR-296-5p上游引物序列：5′-TGCCTAATTCAGAGGGTTGG-3′,下游引物序列：5′-CTCCACTCCTGGCACACAG-3′；U6上游引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.3.3雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將circ_0081143野生型和突變型熒光素酶載體分別與miR-NC和miR-296-5p共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞中,按照說明書檢測(cè)熒光素酶活性。

1.3.4MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

各組786-O細(xì)胞培養(yǎng)48 h,每孔分別加入MTT溶液20 μL,孵育4 h后每孔加入二甲基亞砜150 μL,振蕩反應(yīng)10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度(OD)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.3.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù)

各組786-O細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液,以每孔100個(gè)細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)2周出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)終止培養(yǎng),細(xì)胞清洗2遍后用甲醇固定15 min,然后用結(jié)晶紫染色30 min,低倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落。

1.3.6Transwell小室法檢測(cè)遷移細(xì)胞數(shù)

將各組786-O細(xì)胞在無血清的培養(yǎng)液中饑餓12 h,取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室,培養(yǎng)24 h,取出Transwell小室,甲醇固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色20 min,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細(xì)胞,PBS清洗3遍,風(fēng)干后在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞,并記數(shù)。

1.3.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集各組786-O細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS清洗2次,加入結(jié)合緩沖液重懸,再加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI,混勻、避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3.8蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)

提取各組786-O細(xì)胞的總蛋白,經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入cleaved-caspase3一抗4 ℃孵育過夜,再加入二抗室溫孵育2 h,曝光顯影,定影,分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 circ_0081143和miR-296-5p在腎癌中的表達(dá)

與癌旁組織相比,腎癌組織中circ_0081143表達(dá)水平升高,miR-296-5p表達(dá)水平降低(P<0.05),見表1；circ_0081143小干擾RNA1、2、3轉(zhuǎn)染腎癌細(xì)胞786-O后circ_0081143表達(dá)水平均降低(1.00±0.00vs.0.35±0.03/0.21±0.02/0.28±0.04)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1 648.811,P<0.05)。

表1 腎癌組織中circ_0081143和miR-296-5p表達(dá)的檢測(cè)

2.2 circ_0081143和miR-296-5p靶向關(guān)系的驗(yàn)證

circ_0081143和miR-296-5p有互補(bǔ)序列(圖1)；miR-296-5p與circ_0081143野生型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)；而miR-296-5p與circ_0081143突變型報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化(表2)。si-circ_0081143組(1.00±0.00)miR-296-5p表達(dá)水平高于si-NC組(2.74±0.19)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=27.474,P<0.05)。

圖1 circ_0081143和miR-296-5p的互補(bǔ)序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.3 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O增殖的影響

與si-NC組相比,si-circ_0081143組786-O細(xì)胞抑制率升高,克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；與miR-NC組相比,miR-296-5p mimic組786-O細(xì)胞抑制率升高,克隆形成數(shù)減少(P<0.05)；與si-circ_0081143 組相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor組786-O細(xì)胞抑制率降低,克隆形成數(shù)增加(P<0.05),見圖2,表3。

圖2 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O克隆形成的影響

表3 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O細(xì)胞抑制率和克隆形成數(shù)的檢測(cè)

2.4 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O遷移的影響

與si-NC組相比,si-circ_0081143組786-O遷移細(xì)胞數(shù)減少[164.00±6.71)個(gè)vs.(64.50±1.80)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與miR-NC組相比,miR-296-5p mimic組786-O細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)減少[(167.63±9.51)個(gè)vs.(84.50±2.4)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與si-circ_0081143 組相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor組786-O遷移細(xì)胞數(shù)增加[(64.50±1.80)個(gè)vs.(140.63±6.54)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖3。

圖3 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O遷移細(xì)胞數(shù)的影響

2.5 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O凋亡的影響

與si-NC組相比,si-circ_0081143組786-O細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與miR-NC組相比,miR-296-5p mimic組786-O細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與si-circ_0081143 組相比,si-circ_0081143+miR-296-5p inhibor組786-O細(xì)胞凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05),見圖4,表4。

A：circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O凋亡率的影響；B：circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O中cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的影響。

表4 circ_0081143和miR-296-5p對(duì)786-O凋亡率及cleaved-caspase3蛋白表達(dá)的檢測(cè)

3 討 論

靶向治療在腎癌治療中起重要作用,在腎癌的姑息性治療和術(shù)前輔助治療方面均獲得了顯著的療效[10]。因此,研究腎癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制尋找更多的靶點(diǎn)以開發(fā)新的靶向藥物對(duì)腎癌治療具有重要意義。研究表明circRNA參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程,如敲低circ_0081143減輕了缺氧誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移、侵襲和上皮/間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。為研究circ_0081143對(duì)腎癌細(xì)胞的影響,本實(shí)驗(yàn)先檢測(cè)了腎癌組織中circ_0081143表達(dá)水平,結(jié)果顯示,腎癌組織中circ_0081143高表達(dá),提示circ_0081143可能在腎癌中起促癌作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步沉默circ_0081143后,786-O細(xì)胞抑制率升高,克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少,786-O細(xì)胞凋亡率升高,表明沉默circ_0081143可抑制786-O細(xì)胞增殖和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道m(xù)iR-296-5p在乳頭狀甲狀腺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著下調(diào),miR-296-5p模擬物可抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞克隆形成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。miR-296-5p過表達(dá)抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腎癌組織中miR-296-5p表達(dá)水平降低,提示miR-296-5p可能在腎癌中起抑癌基因作用。且過表達(dá)miR-296-5p后,786-O細(xì)胞抑制率升高,克隆形成數(shù)和遷移細(xì)胞數(shù)減少,786-O細(xì)胞凋亡率升高；表明過表達(dá)miR-296-5p可抑制786-O細(xì)胞增殖和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

研究報(bào)道circPLK1敲低通過調(diào)節(jié)miR-296-5p抑制了三陰性乳腺癌體外細(xì)胞生長和侵襲及體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14]。circ_0000515通過調(diào)節(jié) miR-296-5p/CXCL10 軸影響乳腺癌的進(jìn)展[15]。表明circRNA可通調(diào)控miR-296-5p影響腫瘤進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)通過Circular RNA Interactome生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-296-5p與circ_0081143有結(jié)合位點(diǎn)。且通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)circ_0081143可靶向調(diào)控miR-296-5p,而抑制miR-296-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了沉默circ_0081143對(duì)786-O細(xì)胞的影響。

綜上所述,沉默circ_0081143通過上調(diào)miR-296-5p抑制腎癌細(xì)胞786-O的增殖和遷移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡。