血液透析對(duì)腎衰大鼠心功能的影響及機(jī)制研究*

張 培,朱新旺,孫亞南,穆中一

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科,沈陽 110000;2.遼寧省腫瘤醫(yī)院泌尿外科,沈陽 110000)

腎衰患者病死率高,45%～60%的死亡患者死因?yàn)樾难芗膊?包括心臟結(jié)構(gòu)改變、心力衰竭等[1-2]。研究表明,炎癥為腎衰患者發(fā)生心血管疾病的機(jī)制之一。血液透析為腎衰常用腎臟替代治療方式之一,可經(jīng)對(duì)流、彌散等方式進(jìn)行物質(zhì)交換,對(duì)體內(nèi)代謝廢物進(jìn)行清除,糾正酸堿、電解質(zhì)失衡,提升心血管穩(wěn)定性[3-4]。此外,血液透析在緩解腎衰患者炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激中有一定價(jià)值,有利于保護(hù)心功能,增強(qiáng)右心室游離壁縱向收縮功能,但其作用機(jī)制尚不明確[5]。本研究通過建立腎衰大鼠模型,重點(diǎn)分析血液透析對(duì)腎衰大鼠心功能的影響,并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

40只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠,購自北京生物制品研究所有限責(zé)任公司,許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0051。

1.1.2儀器與試劑

Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)通路激動(dòng)劑脂多糖(LPS，美國Sigma公司)；磷酸肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)試劑盒(北京利德曼生物技術(shù)有限公司)；白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；兔抗大鼠TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3一抗(美國CST公司)；AK-200血液透析器(瑞典Gambro醫(yī)療器械公司)。

1.2 方法

1.2.1模型制備及分組

40只大鼠中取10只作為假手術(shù)組,其余30只制備腎衰大鼠模型[6]。大鼠麻醉后,于左側(cè)肋弓下0.5 cm、脊柱左旁1 cm處,作垂直于脊柱的切口,暴露左腎,結(jié)扎、縫合左腎動(dòng)脈2/3分支,1周后將右腎摘除。建模4周后取尾靜脈血檢測肌酐、尿素氮水平高于假手術(shù)組(P<0.05),表示建模成功。30只大鼠建模成功24只,成功率80%。將24只大鼠隨機(jī)分為模型組、激動(dòng)劑組、血液透析組,每組各8只,假手術(shù)組大鼠不結(jié)扎左腎動(dòng)脈，其余步驟同上。

1.2.2動(dòng)物干預(yù)

建模成功24 h后,血液透析組大鼠右股靜脈留置8 F雙腔靜脈導(dǎo)管,通過小兒專用動(dòng)靜脈透析管路,連接血液透析器,透析面積0.7 m2。肝素抗凝,初始劑量50 U/kg,維持劑量25 U/(kg·h)。血液透析速度隨大鼠血壓變化而調(diào)整,維持55～90 mL/min,透析時(shí)間1 h，1周3次,持續(xù)3周。激動(dòng)劑組血液透析方法同血液透析組,每次透析后,尾靜脈注射10 μg/mL LPS。假手術(shù)組和模型組以1.5 mL 0.9%氯化鈉溶液灌胃,每天1次,持續(xù)3周。

1.2.3心臟超聲檢查

治療結(jié)束后72 h,超聲檢測左心室舒張期末壓(LVEDP)、左心室收縮壓(LVSP)、左心室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)。

1.2.4腎功能指標(biāo)檢測

處死大鼠,取下腔靜脈血,離心取上清液,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測肌酐和尿素氮水平。

1.2.5酶聯(lián)免疫法

取下腔靜脈血,離心,分離血清,采用全自動(dòng)生化分析儀檢測CK、CK-MB水平。

1.2.6HE染色法

切取心肌組織置于4%多聚甲醛,浸蠟、包埋、切片,行HE染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7ELISA法

取部分心肌組織,勻漿,離心取上清液,嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.8qRT-PCR法

取部分心肌組織,提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),以β-actin為內(nèi)參,2-ΔΔCT計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.9Western blot法

取心肌組織,裂解,離心,取上清液,BCA法測定蛋白水平,上樣、電泳、濕轉(zhuǎn)、封閉后,各蛋白抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL顯影,Image J分析條帶灰度值,目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 心功能指標(biāo)

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低(P<0.05),見表2。

表2 各組LVEDP、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax比較

2.2 血清肌酐、尿素氮水平

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組肌酐、尿素氮水平降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組肌酐、尿素氮水平降低(P<0.05),見表3。

表3 各組肌酐、尿素氮水平比較

2.3 血清CK、CK-MB水平

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組CK、CK-MB水平降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組CK、CK-MB水平降低(P<0.05),見表4。

表4 各組CK、CK-MB水平比較

2.4 HE染色結(jié)果

模型組大鼠心肌細(xì)胞肥大,細(xì)胞核溶解、碎裂,心肌纖維排列紊亂,大量炎癥細(xì)胞浸潤；激動(dòng)劑組和血液透析組大鼠肌纖維、肌外膜完整性及心肌細(xì)胞肥大、炎癥細(xì)胞浸潤均有所改善,見圖1。

圖1 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)變化比較(HE×400)

2.5 ELISA檢測結(jié)果

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低(P<0.05),見表5。

表5 各組IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

續(xù)表5 各組IL-6、TNF-α、IL-1β水平比較

2.6 PCR檢測結(jié)果

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組TLR4、caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組TLR4、caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)。各組NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表6。

表6 各組TLR4、NF-κB p65、caspase-3 mRNA相對(duì)

2.7 Western blot法檢測結(jié)果

與模型組比較,激動(dòng)劑組和血液透析組TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p6降低(P<0.05)；與激動(dòng)劑組比較,血液透析組TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p6降低(P<0.05)。各組NF-κB p65 蛋白相對(duì)表達(dá)量組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見圖2、表7。

圖2 心肌組織TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3 蛋白灰度值比較

表7 各組TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-NF-κB p65/NF-κB p65比較

3 討 論

目前,腎衰患者心功能損傷具體機(jī)制尚不明確,其中,炎癥為腎衰患者發(fā)生心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[7]。血液透析屬于血液凈化技術(shù)的一種,可減輕炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)[8]。目前,國內(nèi)尚無腎衰大鼠血液透析的相關(guān)報(bào)道。

章穎虹[9]研究認(rèn)為血液透析與心功能指標(biāo)、炎癥狀態(tài)有一定相關(guān)性。此外,血液透析還被證實(shí)能通過對(duì)心血管相關(guān)蛋白結(jié)合毒素進(jìn)行清除,發(fā)揮保護(hù)心血管作用[10]。本研究結(jié)果顯示,血液透析可促使大鼠LVEDP升高,LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、血肌酐、尿素氮、CK、CK-MB及心肌組織IL-6、TNF-α、IL-1β水平下降；病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn),血液透析可改善大鼠心肌纖維、肌外膜完整性,減輕心肌細(xì)胞肥大、炎性細(xì)胞浸潤,這說明血液透析可保護(hù)腎衰大鼠心功能,減輕炎性反應(yīng),減少心肌損傷。

TLR4是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受體蛋白,與免疫炎性反應(yīng)密切相關(guān),在巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞內(nèi)廣泛表達(dá),可啟動(dòng)氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)[11]。TLR4激活后可通過髓樣分子依賴途徑,對(duì)下游NF-κB進(jìn)行激活,介導(dǎo)下游炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致IL-6、TNF-α、IL-1β等大量炎癥因子分泌、釋放,促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[12]。而心肌細(xì)胞凋亡在心功能損傷中也發(fā)揮重要作用,且由相關(guān)基因調(diào)控,其中caspase家族較常見[13]。本研究結(jié)果顯示,血液透析可抑制TLR4、p-NF-κB p65、caspase-3 蛋白相對(duì)表達(dá)量并降低p-NF-κB p65/NF-κB p65,且經(jīng)應(yīng)用TLR4/NF-κB通路激動(dòng)劑進(jìn)一步驗(yàn)證,這提示血液透析可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路,這可能是血液透析發(fā)揮大鼠心功能保護(hù)作用的機(jī)制之一。

綜上所述,血液透析可減輕腎衰大鼠腎損傷及炎性反應(yīng),保護(hù)心功能,并可能通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。由于本研究涉及的樣本量較少,今后仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。